Гемоглобин в крови животных. Как определить его количество, и зачем это нужно? Гемоглобин, гематокрит - физиология сельскохозяйственных животных

ГЕМОГЛОБИН , Hb (haemoglobinum ; греч. haima кровь + лат. globus шарик),- гемопротеид, сложный белок, относящийся к гемсодержащим хромопротеидам; осуществляет перенос кислорода от легких к тканям и участвует в переносе углекислого газа от тканей в органы дыхания. Г. содержится в эритроцитах всех позвоночных и некоторых беспозвоночных животных (черви, моллюски, членистоногие, иглокожие), а также в корневых клубеньках некоторых бобовых растений. Мол. вес (масса) Г. эритроцитов человека равен 64 458; в одном эритроците находится ок. 400 млн. молекул Г. В воде Г. хорошо растворим, нерастворим в спирте, хлороформе, эфире, хорошо кристаллизуется (форма кристаллов Г. различных животных неодинакова).

В состав Г. входит простой белок- глобин и железосодержащая простетическая (небелковая) группа - гем (96 и 4% от массы молекулы соответственно). При pH ниже 2,0 происходит расщепление молекулы Г. на гем и глобин.

Гем

Гем (C 34 H 32 O 4 N 4) представляет собой железопротопорфирин- комплексное соединение протопорфирина IX с двухвалентным железом. Железо находится в центре протопорфиринового ядра и связано с четырьмя атомами азота пиррольных ядер (рис. 1): две связи координационные и две связи с замещением водорода.

Поскольку координационное число железа равно 6, две валентности остаются неиспользованными, одна из них реализуется при связывании гема с глобином, а ко второй присоединяется кислород или другие лиганды - CO, F + , азиды, вода (рис. 2) и т. д.

Комплекс протопорфина IX с Fe 3+ называют гематином. Солянокислая соль гематина (хлоргемин, гемин) легко выделяется в. кристаллическом виде (так наз. кристаллы Тейхманна). Гем обладает способностью образовывать комплексные соединения с азотистыми соединениями (аммиаком, пиридином, гидразином, аминами, аминокислотами, белками и т. д.), превращаясь при этом в гемохромогены (см.). Поскольку у всех видов животных гем одинаков, то различия в свойствах гемоглобинов обусловлены особенностями строения белковой части молекулы Г. - глобина.

Глобин

Глобин - белок типа альбуминов, содержит в своей молекуле четыре полипептидные цепи: две альфа-цепи (в каждую из которых входит по 141 аминокислотному остатку) и две бета-цепи, содержащие по 146 остатков аминокислот. Т. о., белковый компонент молекулы Г. построен из 574 остатков различных аминокислот. Первичная структура, т. е. генетически обусловленная последовательность расположения аминокислот в полипептидных цепях глобина человека и ряда животных, полностью изучена. Отличительной особенностью глобина человека является отсутствие в его составе аминокислот изо лейцина и цистина. N-концевыми остатками в альфа- и бета-цепях являются остатки валина. C-концевые остатки альфа-цепей представлены остатками аргинина, а бета-цепей - гистидина. Предпоследнее положение в каждой из цепей занимают остатки тирозина.

Рентгеноструктурный анализ кристаллов Г. позволил выявить основные особенности пространственной структуры его молекулы [Перутц (М. Perutz)]. Оказалось, что альфа- и бета-цепи содержат спиральные сегменты различной длины, которые построены по принципу альфа-спиралей (вторичная структура); альфа-цепь имеет 7, а бета-цепь - 8 спиральных сегментов, соединенных неспиральными участками. Спиральные сегменты, начиная с N-конца, обозначаются буквами латинского алфавита (А, В, С, D, E, F, G, Н), а неспиральные участки или углы поворота спиралей имеют соответствующее обозначение (АВ, ВС, CD, DE и т. д.). Неспиральные участки на аминном (N) или карбоксильном (С) конце цепи глобина обозначают соответственно NA или НС. Аминокислотные остатки нумеруются в каждом сегменте и, кроме того, в скобках дается нумерация данного остатка от N-конца цепи.

Спиральные и неспиральные участки определенным образом уложены в пространстве, что определяет третичную структуру цепей глобина. Последняя почти идентична у альфа- и бета-цепей Г., несмотря на значительные различия в их первичной структуре. Это обусловлено специфическим расположением полярных и гидрофобных групп аминокислот, приводящим к скоплению неполярных групп во внутренней части глобулы с образованием гидрофобного ядра. Полярные группы белка обращены к водной среде, находясь с ней в контакте. Внутри каждой цепи глобина недалеко от поверхности находится гидрофобная впадина («гемовый карман»), в к-рой располагается гем, ориентируясь так, что его неполярные заместители направлены во внутрь молекулы, входя в состав гидрофобного ядра. В результате возникает ок. 60 неполярных контактов между гемом и глобином и один-два полярных (ионных) контакта гема с альфа- и бета-цепями, в которых участвуют остатки пропионовой к-ты гема, выходящие наружу из гидрофобного «кармана». Расположение гема в гидрофобной впадине глобина обеспечивает возможность обратимого присоединения кислорода к Fe 2+ гема без окисления последнего до Fe 3+ и характерно для гемоглобинов различных видов животных. Подтверждением этого является крайняя чувствительность Г. к любым изменениям неполярных контактов вблизи гема. Так, замена гема в Г. на гематопорфирин приводит к резкому нарушению свойств Г.

Некоторые аминокислотные остатки, окружающие гем в гидрофобной впадине, относятся к числу инвариантных аминокислот, т. е. аминокислот, одинаковых для различных видов животных и существенных для функции Г. Среди инвариантных аминокислот большое значение отводится трем: остаткам гистидина, так наз. проксимальным гистидинам (87-я позиция в а- и 92-я позиция в P-цепях), дистальным гистидинам (58-я позиция в а- и 63-я позиция в (5-цепях), a также остатку валина Е-11 (62-я позиция в альфа-цепи и 67-я позиция в бета-цепи).

Связь между так наз. проксимальным гистидином и железом гема является единственной хим. связью между ними (реализуется пятая координационная связь атома Fe 2+ гема) и непосредственно влияет на присоединение кислорода к гему. «Дистальный» гистидин непосредственно не связан с гемом и участия в фиксировании кислорода не принимает. Его значение состоит в стабилизации атома Fe 2+ против необратимого окисления (по-видимому, за счет образования водородной связи между кислородом и азотом). Остаток валина (Е-11) является своего рода регулятором скорости присоединения кислорода к гемам: в бета-цепях он стерически расположен так, что занимает то место, куда должен присоединиться кислород, вследствие чего оксигенация начинается с фльфа-цепей.

Белковая часть и простетическая группа молекулы Г. оказывают друг на друга сильное влияние. Глобин изменяет многие свойства гема, придавая ему способность к связыванию кислорода. Гем обеспечивает устойчивость глобина к действию к-т, нагреванию, расщеплению ферментами и обусловливает особенности кристаллизационных свойств Г.

Полипептидные цепи с присоединенными к ним молекулами гема образуют четыре основные части - субъединицы молекулы Г. Характер соединения (укладки) их между собой ц расположение в пространстве определяют особенности четвертичной структуры Г.: а- и P-цепи располагаются по углам тетраэдра вокруг оси симметрии, причем альфа-цепи лежат поверх p-цепей и как бы втискиваются между ними, а все четыре гема далеко удалены друг от друга (рис. 3). В целом образуется тетрамерная сфероидная частица с размерами 6,4 X 5,5 х 5,0 нм. Четвертичная структура стабилизирована солевыми связями между α-α- и β-β-цепями и двумя видами контактов между α и β-цепями (α1-β1 и α2-β2). Контакты α1-β1 наиболее обширны, в них участвуют 34 аминокислотных остатка, большинство взаимодействий неполярно. Контакт α1-β2 включает 19 аминокислотных остатков, большинство связей также неполярно, за исключением нескольких водородных связей. Все остатки, находящиеся в этом контакте, одинаковы у всех изученных видов животных, в то время как 1/3 остатков в α1-β1-контактах варьирует.

Г. человека гетерогенен, что обусловлено различием полипептидных цепей, входящих в его состав. Так, Г. взрослого человека, составляющий 95-98% Г. крови (HbA), содержит две α- и две β-цепи; малая фракция Г. (HbA2), достигающая максимального содержания 2,0-2,5%, содержит две α- и две σ-цепи; гемоглобин плода (HbF), или фетальный гемоглобин, составляющий в крови взрослого человека 0,1-2% , состоит из двух α- и двух γ-цепей.

Фетальный Г. заменяется на HbA в первые месяцы после рождения. Он характеризуется значительной устойчивостью к тепловой денатурации, на чем основаны методы определения его содержания в крови.

В зависимости от состава полипептидных цепей перечисленные типы Г. обозначаются следующим образом: HbA - как Hbα2β2, HbA2 - как Hbα2σ2, a HbF - как Hbα2γ. При врожденных аномалиях и заболеваниях кроветворного аппарата появляются аномальные типы Г., напр, при серповидноклеточной анемии (см.), талассемии (см.), врожденной метгемоглобинемии неэнзиматического происхождения (см. Метгемоглобинемия) и др. Наиболее часто встречается замещение единственной аминокислоты в одной паре полипептидных цепей.

В зависимости от величины валентности атома железа гема и типа лиганда в молекуле Г. последний может находиться в нескольких формах. Восстановленный Г. (дезокси-Hb) имеет Fe 2+ со свободной шестой валентностью, при присоединении к нему O 2 образуется оксигенированная форма Г. (HbO 2). При действии на HbO 2 ряда окислителей (феррицианид калия, нитриты, хиноны и др.) происходит окисление Fe 2+ до Fe 3+ с образованием метгемоглобин, неспособного к переносу O 2 . В зависимости от величины pH среды различают кислую и щелочную форму метгемоглобина, содержащих в качестве шестого лиганда H 2 O или OH-группу. В крови здоровых людей концентрация метгемоглобина составляет 0,83+0,42% .

Метгемоглобин обладает способностью прочно связывать фтористый водород, синильную к-ту и другие вещества. Этим его свойством пользуются в мед. практике для спасения людей, отравленных синильной к-той. Различные производные Г. различаются по спектрам поглощения (табл.).

Некоторые характеристики спектров поглощения производных гемоглобина (миллиэквивалентные характеристики даны из расчета на 1 гем)

Производное гемоглобина	Длина волны (при максимуме поглощений), нм	Миллиэквивалентный коэффициент светопоглощения, E
Дезоксигемоглобин
Оксигемоглобин (HbO2)
Карбоксигемоглобин (HbCO)
Метгемоглобин (мет-Hb; pH 7,0-7,4)
Циан-метгемоглобин (CN-мет-Hb)

Функциональные свойства гемоглобина. Основная биол, роль Г.- участие в газообмене между организмом и внешней средой. Г. обеспечивает перенос кровью кислорода от легких к тканям и транспорт углекислоты от тканей к легким (см. Газообмен). Не менее важны и буферные свойства Г., образующего мощные гемоглобинную и оксигемоглобинную буферные системы крови, способствующие, т. о., поддержанию кислотно-щелочного равновесия в организме (см. Буферные системы , Кислотно-щелочное равновесие).

Кислородная емкость HbO 2 составляет 1,39 мл O 2 на 1 г HbO 2 . Способность Г. связывать и отдавать кислород отражается его кислородно-диссоциационной кривой (КДК), характеризующей процент насыщения Г. кислородом в зависимости от парциального давления O 2 (pO 2).

Тетрамерные молекулы Г. имеют S-образную форму КДК, что свидетельствует о том, что Г. обеспечивает оптимальное связывание кислорода при относительно низком его парциальном давлении в легких и отдачу - при сравнительно высоком парциальном давлении кислорода в тканях (рис. 4). Максимальная отдача кислорода тканям сочетается с сохранением высокого парциального давления его в крови, что обеспечивает проникновение кислорода в глубь тканей. Величина парциального давления кислорода в мм рт. ст., при к-рой 50% Г. оксигенировано, является мерой сродства Г. к кислороду и обозначается Р50.

Присоединение кислорода к четырем гемам Г. происходит последовательно. S-образный характер КДК Г. свидетельствует о том, что первая молекула кислорода соединяется с Г. очень медленно, т. е. ее сродство к Г. невелико, поскольку требуется разорвать солевые контакты в молекуле дезоксигемоглобина. Однако присоединение первой молекулы кислорода увеличивает сродство к нему оставшихся трех гемов, и дальнейшая оксигенация Г. происходит значительно быстрее (оксигенация четвертого гема происходит в 500 раз быстрее, чем первого). Следовательно, налицо кооперативное взаимодействие между центрами, связывающими кислород. Закономерности реакции Г. с окисью углерода (СО) те же, что и для кислорода, но сродство Г. к СО почти в 300 раз выше, чем к O 2 , что обусловливает высокую ядовитость угарного газа. Так, при концентрации СО в воздухе, равной 0,1%, больше половины Г. крови оказывается связанным не с кислородом, а с угарным газом. При этом происходит образование карбоксигемоглобина, неспособного к переносу кислорода.

Регуляторы процесса оксигенации гемоглобина. Большое влияние на процессы оксигенации и дезоксигенации оказывают водородные ионы, органические фосфаты, неорганические соли, температура, углекислота и некоторые другие вещества, контролирующие величину сродства Г. к кислороду в соответствии с физиол. запросами организма. Зависимость сродства Г. к кислороду от величины pH среды носит название эффекта Бора (см. Вериго эффект). Различают «кислый» (рН<6) и «щелочной» эффект Бора (pH>6). Наибольшее физиол. значение имеет «щелочной» эффект Бора. Его молекулярный механизм обусловлен наличием в молекуле Г. ряда положительно заряженных функциональных групп, константы диссоциации которых значительно выше в дезоксигемоглобине за счет образования солевых мостиков между отрицательно заряженными группами соседних белковых цепей внутри молекулы Г. В процессе оксигенации вследствие происходящих конформационных изменений молекулы Г. солевые мостики разрушаются, изменяется pH отрицательно заряженных групп и протоны выделяются в р-р. Следовательно, оксигенация приводит к отщеплению протона (H +) от молекулы Г. и, наоборот, изменение величины pH, т. е. косвенно концентрации ионов H + , среды влияет на присоединение к Г. кислорода. Т. о., H + становится лигандом, связывающимся преимущественно с дезоксигемоглобином и тем самым уменьшающим его сродство к кислороду, т. е. изменение величины pH в кислую сторону вызывает сдвиг КДК вправо. Процесс оксигенации является эндотермическим, и повышение температуры способствует отщеплению кислорода от молекулы Г. Следовательно, усиление деятельности органов и повышение температуры крови вызовет сдвиг КДК вправо, и отдача кислорода тканям увеличится.

Своеобразную регуляцию процесса оксигенации осуществляют органические фосфаты, локализующиеся в эритроцитах. В частности, 2,3-дифосфоглицерат (ДФГ) значительно уменьшает сродство Г. к кислороду, способствуя отщеплению O 2 от оксигемоглобина. Влияние ДФГ на Г. возрастает при уменьшении значения pH (в пределах физиол, области), поэтому его влияние на КДК Г. проявляется в большей степени при низких величинах pH. ДФГ связывается преимущественно с дезоксигемоглобином в молярных соотношениях 1:1, входя во внутреннюю впадину его молекулы и образуя 4 солевых мостика с двумя альфа-NH 2 -группами остатков валина бета-цепей и, по-видимому, с двумя имидазольными группами гистидинов Н-21 (143) бета-цепей. Влияние ДФГ уменьшается с увеличением температуры, т. е. процесс связывания ДФГ с молекулой Г. является экзотермическим. Это приводит к тому, что в присутствии ДФГ в значительной мере исчезает зависимость процесса оксигенации от температуры. Следовательно, нормальное освобождение кислорода кровью делается возможным в широком интервале температур. Аналогичный эффект, хотя и в меньшей степени, оказывают АТФ, пиридоксальфосфата другие органические фосфаты. Т. о., концентрация органических фосфатов в эритроцитах оказывает значительное действие на дыхательную функцию Г., быстро приспосабливая ее к различным физиол, и патол, условиям, связанным с нарушением оксигенации * (изменение содержания кислорода в атмосфере, кровопотеря, регуляция транспорта кислорода от матери к плоду через плаценту и т. п.). Так, при анемии и гипоксии в эритроцитах увеличивается содержание ДФГ, что сдвигает КДК вправо и вызывает большую отдачу кислорода тканям. Многие нейтральные соли (ацетаты, фосфаты, хлориды калия и натрия) также уменьшают сродство Г. к кислороду. Этот эффект зависит от природы вещества и сходен с эффектом органических фосфатов. В присутствии высокой концентрации соли сродство Г. к кислороду достигает минимума - в одинаковой степени для различных солей и ДФГ, т. е. и соли, и ДФГ конкурируют друг с другом за одни и те же центры связывания на молекуле Г. Так, напр., влияние ДФГ на сродство Г. к кислороду исчезает в присутствии 0,5 М хлорида натрия.

Еще в 1904 г. Бор (Ch. Bohr) с сотр. показал уменьшение сродства Г. к кислороду при увеличении парциального давления углекислого газа в крови.

Увеличение содержания углекислого газа приводит в первую очередь к изменению pH среды, однако значение Р50 уменьшается в большей степени, чем это следовало бы ожидать при таком уменьшении зна

чения pH. Это обусловлено специфическим взаимоотношением углекислого газа с незаряженными альфа-NH2-группами альфа-цепей, а возможно, и бета-цепей Г. с образованием карбаматов (карбгемоглобина) по следующей схеме:

HbNH 3 + <-> HbNH 2 + H +

HbNH 2 + CO 2 <-> HbNHCOO - + Н +

Дезоксигемоглобин связывает большее количество углекислого газа, чем HbO 2 . В эритроците присутствие ДФГ конкурентно ингибирует образование карбаматов. С помощью карбаматного механизма из организма здоровых людей в покое выводится до 15% углекислого газа. Более 70% буферной емкости крови обеспечивается находящимся в ней Г., что приводит и к значительному косвенному участию Г. в переносе углекислого газа. При протекании крови через ткани HbO 2 переходит в дезоксигемоглобин, связывая при этом ионы H+ и переводя тем самым H 2 CO 3 в HCO 3 - . Т. о., при прямом и косвенном участии Г. связывается более 90% углекислоты, поступающей из тканей в кровь, и переносится в легкие.

Существенно, что все указанные регуляторы сдвига КДК (H + , ДФГ, CO 2) являются взаимосвязанными между собой, что имеет большое значение при ряде возникающих патол, состояний. Так, увеличение концентрации ДФГ в эритроцитах является результатом сложных изменений в их метаболизме, в к-ром увеличение значения pH является основным условием. При ацидозе и алкалозе также вследствие взаимосвязи между H + и ДФГ происходит выравнивание величины P 50 .

Метаболизм гемоглобина

Биосинтез Г. происходит в молодых формах эритроцитов (эритробластах, нормобластах, ретикулоцитах), куда проникают атомы железа, включаемые в состав Г. В синтезе порфиринового кольца принимают участие глицин и янтарная к-та с образованием δ-аминолевулиновой к-ты. Две молекулы последней превращаются в пиррольное производное - предшественник порфирина. Глобин образуется из аминокислот, т. е. обычным путем синтеза белка. Распад Г. начинается в эритроцитах, заканчивающих свой жизненный цикл. Гем окисляется по альфа-метиновому мостику с разрывом связи между соответствующими кольцами пиррола.

Полученное производное Г. называют вердоглобином (пигмент зеленого цвета). Он очень неустойчив и легко распадается на ион железа (Fe 3+), денатурированный глобин и биливердин.

Большое значение в катаболизме Г. отводят гаптоглобин-гемоглобиновому комплексу (Hp-Hb). При выходе из эритроцита в кровяное русло Г. необратимо связывается с гаптоглобином (см.) в Hp-Hb комплекс. После истощения всего количества Hp в плазме Г. абсорбируется проксимальными канальцами почек. Основная масса глобина распадается в почках в течение 1 часа.

Катаболизм гема в Hp-Hb комплексе осуществляется ретикулоэндотелиальными клетками печени, костного мозга и селезенки с образованием желчных пигментов (см.). Отщепляющееся при этом железо очень быстро поступает в метаболический фонд и используется в синтезе новых молекул Г.

Методы определения концентрации гемоглобина. В клин, практике Г. определяют обычно колориметрическим методом с помощью гемометра Сали, основанном на измерении количества гемина, образующегося из Г. (см. Гемоглобинометрия). Однако в зависимости от содержания в крови билирубина и метгемоглобина, а также при некоторых патол, состояниях ошибка метода достигает +30%. Более точными являются спектрофотометрические методы исследования (см. Спектрофотометрия).

Для определения общего гемоглобина в крови используют цианметгемоглобиновый метод, основанный на превращении всех производных Г. (дезокси-Hb, HbO 2 , HbCO, мет-Hb и др.) в циан-мет-Hb и измерении величины оптической плотности р-ра при 540 нм. Для той же цели используют пиридин-гемохромогенный метод. Концентрацию HbO 2 обычно определяют по поглощению света при 542 нм или газометрическим методом (по количеству связанного кислорода).

Гемоглобин в клинической практике

Определение количественного содержания и качественного состава Г. используется в комплексе с другими гематол. показателями (показатель гематокрита, числа эритроцитов, их морфология и др.) для диагностики ряда патол, состояний красной крови (анемии, эритремии и вторичные эритроцитозы, оценка степени кровопотери, сгущения крови при дегидратации организма и ожогах и др.), для оценки эффективности гемо-трансфузий в процессе терапии и т. д.

В норме содержание Г. в крови составляет в среднем для мужчин 14,5 + 0,06 г% (колебания 13,0-16,0 г%) и для женщин 12,9 + 0,07 г% (12,0-14,0 г%), по данным Л. Э. Ярустовской и соавт. (1969); колебания зависят от возрастных и конституциональных особенностей организма, физ. активности, характера питания, климата, парциального давления кислорода в окружающем воздухе. Концентрация Г. в крови является относительной величиной, зависящей не только от абсолютного количества общего Г. в крови, но и от объема плазмы. Увеличение объема плазмы при неизменном количестве Г. в крови может давать при определении Г. заниженные цифры и имитировать анемию.

Для более полной оценки содержания Г. применяют также косвенные показатели: определение цветного показателя, среднего содержания Г. в одном эритроците, среднеклеточной концентрации Г. по отношению к показателю гематокрита и т. д.

Встречающееся при тяжелых формах анемии снижение концентрации Г. в крови до определенной критической величины - 2-3 г% и ниже (гемоглобинопения, олигохромемия) - обычно ведет к смерти, однако при некоторых видах хрон, анемий отдельные больные вследствие развития компенсаторных механизмов адаптируются и к такой концентрации.

При патол, состояниях содержание Г. и количество эритроцитов не всегда изменяются параллельно, что находит отражение в классификации анемий (различают нормо-, гипо- и гиперхромные формы анемии); эритремия и вторичные эритроцитозы характеризуются повышенной концентрацией Г. (гиперхромемией) и увеличением количества эритроцитов одновременно.

Практически весь Г. крови находится внутри эритроцитов; часть его находится в плазме в виде комплекса Hp-Hb. Свободный Г. плазмы составляет в норме 0,02-2,5 мг% (по Г. В. Дервизу и Н. К. Бялко). Содержание свободного Г. в плазме повышается при некоторых гемолитических анемиях, протекающих преимущественно с внутрисосудистым гемолизом (см. Гемоглобинемия).

В связи с наличием нескольких нормальных типов Г., а также появлением в крови при некоторых заболеваниях аномальных гемоглобинов различного происхождения (см. Гемоглобинопатии) большое внимание уделяется определению качественного состава Г. эритроцитов («гемоглобиновой формулы»). Так, обнаружение повышенных количеств Г. типа HbF и HbA2 характерно обычно для некоторых форм бета-талассемии.

Повышение содержания HbF отмечено и при других гематол. болезнях (острый лейкоз, апластическая анемия, пароксизмальная ночная Гемоглобинурия и др.), а также при инфекционном гепатите, при бессимптомном наследственном персистировании фетального гемоглобина и беременности. Концентрация фракции HbA2 в крови повышается при наличии некоторых нестабильных Г., интоксикациях и снижается при железодефицитной анемии.

В онтогенезе у человека отмечается смена различных типов нормальных Г. У плода (до 18 нед.) обнаруживают первичный, или примитивный, гемоглобин P (англ. primitive); его разновидности обозначают так же, как Hb Gower1 и Hb Gower2.

Преобладание первичного Г. соответствует периоду желточного кроветворения, а в следующий за ним период печеночного кроветворения синтезируется уже преимущественно HbF.

Синтез «взрослого» HbA резко интенсифицируется в период костномозгового кроветворения; содержание HbF у новорожденного ребенка составляет до 70-90 % общего количества Г. (остальные 10-30% приходятся на фракцию HbA). К концу первого года жизни концентрация HbF обычно снижается до 1-2% , и соответственно возрастает содержание HbA.

Известно св. 200 аномальных (патол. или необычных) вариантов Г., появление которых обусловливается различными наследственными дефектами образования полипептидных цепей глобина.

Открытие Л. Полинга, Итано (Н. А. Itano) и сотр. в 1949 г. патол, гемоглобина S (англ. sickle cell серповидноклеточный) положило начало учению о молекулярных болезнях. Наличие в эритроцитах аномального Г. обычно (но не всегда) приводит к развитию синдрома наследственной гемолитической анемии (см.).

Большинство из описанных вариантов гемоглобина следует считать не патологическими, а скорее редкими необычными формами Г. С мед. позиций определенное значение имеют гемоглобины S, С, D, Е, Bart, H, М и большая группа (ок. 60) нестабильных Г. Нестабильными Г. называют аномальные варианты Г., у которых в результате замены одной из аминокислот возникла неустойчивость молекулы к действию окислителей, нагревания и ряда других факторов. Г. М-группы возникают вследствие замен аминокислот в полипептидных цепях в области контактов гема и глобина, что приводит не только к неустойчивости молекулы, но и к повышенной склонности к метгемоглобинообразованию. M-гемоглобинопатия нередко является причиной наследственной метгемоглобинемии (см.).

Классификация Г. первоначально была основана на изображении их в порядке открытия буквами латинского алфавита; исключение сделано для нормальных «взрослых» Г., обозначенных буквой А, и Г. плода (HbF). Буквой S обозначен аномальный серповидноклеточный Г. (синоним HbB). Т. о., буквы латинского алфавита от А до S считались общепризнанными обозначениями Г. Согласно принятой на X Международном гематол. конгрессе (Стокгольм, 1964) номенклатуре Г. впредь для обозначения новых вариантов не рекомендуется использовать остальные буквы алфавита.

Вновь открываемые формы Г. теперь принято называть по месту открытия с использованием названия города (области), б-цы или лаборатории, где новый Г. был впервые обнаружен, и с указанием (в скобках) его биохим, формулы, места и характера аминокислотной замены в пораженной цепи. Напр., Hb Koln (альфа 2 бета 2 98 val->met) означает, что в гемоглобине Кёльн произошла замена в 98-й позиции одной из бета-полипептидных цепей аминокислоты валина на метионин.

Все разновидности Г. отличаются друг от друга по физ.-хим. и физ. свойствам, а некоторые и по функциональным свойствам, на чем основаны методы обнаружения различных вариантов Г. в клинике. Открыт новый класс аномальных Г. с измененным сродством к кислороду. Типирование Г. производится с помощью электрофореза и ряда других лабораторных методов (пробы на щелочеустойчивость и тепловую денатурацию, спектрофотометрия и др.).

По электрофоретической подвижности Г. делятся на быстродвижущиеся, медленные и нормальные (имеющие подвижность, одинаковую с HbA). Однако замена аминокислотных остатков не всегда приводит к изменению заряда молекулы Г., поэтому некоторые варианты не могут быть выявлены с помощью электрофореза.

Гемоглобин в судебно-медицинском отношении

Г. и его производные в судебной медицине определяются для установления наличия крови на вещественных доказательствах или в каких-либо жидкостях при диагностике отравлений веществами, вызывающими изменения Г., для отличия крови, принадлежащей плоду или новорожденному, от крови взрослого человека. Имеются данные об использовании особенностей Г., передающихся по наследству, в экспертизе спорного отцовства, материнства и замены детей, а также в целях индивидуализации крови на вещественных доказательствах.

Путем иммунизации животных гемоглобином человека были получены гемоглобинпреципитирующие сыворотки. При помощи этих сывороток в исследуемом на Г. пятне может быть установлено присутствие крови человека.

При установлении наличия крови в пятнах применяется микроспектральный анализ и микрокристаллические реакции. В первом случае Г. щелочью и восстановителем переводится в гемохромоген, который имеет характерный спектр поглощения (см. Гемохромоген), или на Г. действуют концентрированной серной к-той, что приводит к образованию гематопорфирина., Последний обладает типичным спектром поглощения в видимой части спектра.

Из микрокристаллических реакций для установления наличия крови наиболее часто пользуются пробами, основанными на получении кристаллов гемохромогена и солянокислого гемина. Для получения кристаллов гемина из ткани с пятном, исследуемым на Г., берут ниточку и помещают на предметное стекло, добавляют несколько кристаллов хлорида натрия и несколько капель концентрированной уксусной к-ты (реактив Тейхманна). При нагревании (в случае присутствия крови) из Г. образуются кристаллы солянокислого гемина (кристаллы Тейхманна)- коричневого цвета косые параллелограммы, иногда применяются реакции получения из Г. кристаллов йод-гемина - мелкие кристаллы черного цвета в форме ромбических призм.

Производные Г. спектроскопически устанавливаются в крови при некоторых отравлениях. Напр., при отравлении окисью углерода в крови пострадавших обнаруживается карбоксигемоглобин, при отравлении метгемоглобинобразующими веществами - метгемоглобин.

В делах о детоубийстве бывает необходимым установить на различных вещественных доказательствах присутствие крови новорожденного или плода. Поскольку в крови плода и новорожденного наблюдается высокое содержание HbF, а в крови взрослого человека - HbА, различаемых по своим физ.-хим. свойствам, Г. новорожденного (плода) и взрослого человека могут быть легко отдифференцированы.

На практике чаще всего используют щелочную денатурацию, т. к. Г. плода более устойчив к действию щелочей, чем Г. взрослого человека. Изменения Г. устанавливаются спектроскопически, спектрофотометрически или фотометрически.

Синтез полипептидных цепей Г. осуществляется под контролем структурных и (возможно) регуляторных генов. Структурные гены обусловливают определенную аминокислотную последовательность полипептидных цепей, регуляторные- скорость их синтеза (см. Ген).

Существующие 6 типов цепей нормального г. (Hbα, Hbβ, Hbγ, Hbδ, Hbε, Hbζ) у человека кодируются соответственно 6 генными локусами (α, β, γ, δ, ε, ζ). Полагают, что для α-цепей могут существовать два локуса. Кроме того, обнаружено 5 разных γ-цепей, которые кодируются разными локусами. Т. о., всего у человека может быть от 7 до 10 пар структурных генов, контролирующих синтез Г.

Изучение стадий развития показало, что у человека существует четкая и хорошо сбалансированная генетическая регуляция синтеза различных Г. В первой половине утробной жизни у человека активны гл. обр. локусы α, γ, ζ, ε-цепей (последний лишь кратковременно, в раннем периоде эмбриональной жизни). После рождения одновременно с выключением локуса гамма-цепей активируются локусы β, δ-цепей. В результате такого переключения происходит замена фетального Г. (HbF) на гемоглобины взрослого человека -HbA с малой фракцией HbA2.

Неясными вопросами остаются расположение генных локусов, определяющих синтез Г. на хромосомах, их сцепление, зависимость специфической и связанной с периодами онтогенеза активации и репрессии структурных генов Г. от действия регуляторных генов, влияния гуморальных факторов (напр., гормонов) и т. д.

Синтез цепей глобина представляет собой частный пример синтеза белка в клетке.

Хотя в регуляции синтеза Г. еще много неясного, однако, по-видимому, ключевыми являются механизмы, контролирующие скорость транскрипции иРНК (информационной РНК) с ДНК. Точной характеристики ДНК, специфически ответственной за синтез глобина, не получено. Однако в 1972 г. одновременно в нескольких лабораториях удалось синтезировать ген, регулирующий синтез Г. Это было сделано с помощью фермента обратной транскриптазы (см. Генная инженерия).

Гемовая часть молекулы Г. синтезируется отдельно с помощью серии ферментативных реакций, начиная с активного сукцината (янтарной к-ты) из цикла Кребса и кончая сложным протопорфириновым кольцом с атомом железа в центре.

В процессе белкового синтеза глобиновые цепи принимают характерную для них конфигурацию, и гем «вкладывается» в специальный карман. Далее происходит сочетание завершенных цепей Г. с образованием тетрамера.

Синтез специфической ДНК происходит в предшественниках эритроцитов только до стадии ортохромного нормобласта. За этот период создается окончательный набор полипептидных цепей глобина, происходит его соединение с гемом, образуются все разновидности РНК и необходимых ферментов.

Наследственные нарушения синтеза Г. делятся на две большие группы:

1) так наз. структурные варианты или аномалии первичной структуры Г.- «качественные» гемоглобинопатии типа Hb, S, С, D, E, М, а также заболевания, вызываемые нестабильными Г. и Г. с повышенным сродством к O 2 (см. Гемоглобинопатии),

2) состояния, возникающие вследствие нарушенной скорости синтеза одной из полипептидных цепей глобина - «количественные» гемоглобинопатии или талассемии (см.).

При структурных вариантах может изменяться стабильность и функция молекулы Г. При талассемиях структура глобина может быть нормальной. Т. к. во многих популяциях людей распространены оба типа генетического дефекта, то нередко наблюдаются индивидуумы, одновременно гетерозиготные по структурному варианту Г. и по талассемии. Сочетания различных генов составляют весьма сложный спектр гемоглобинопатий. В некоторых случаях мутации могут поражать механизмы переключения синтеза Г., что приводит, напр., к продолжению синтеза фетального Г. у взрослых. Эти состояния носят групповое название наследственной персистенции фетального гемоглобина.

К вариантам со слившимися цепями относятся мутанты типа Hb Lepore, anti-Lepore и Kenya. Наиболее вероятно, что эти структурные аномалии Г. возникли вследствие неравного негомологичного мейотического кроссинговера между тесно сцепленными генами Г. В результате этого, напр., в Hb Lepore α-цепи нормальны, а другие полипептидные цепи содержат часть последовательности δ- и часть последовательности β-полипептидных цепей.

Поскольку мутации могут возникнуть в любом из генов, определяющих синтез Г., может сложиться несколько ситуаций, при которых индивидуумы будут гомозиготами, гетерозиготами или двойными гетерозиготами по аллелям аномальных Г. в одном или нескольких локусах.

Известно более 200 структурных вариантов Г., из них охарактеризовано более 120, и во многих случаях удалось связать структурное изменение Г. с его аномальной функцией. Простейший механизм возникновения нового варианта Г. в результате точковой мутации (замены единственного основания в генетическом коде) может быть продемонстрирован на примере HbS (схема).

Влияние аминокислотного замещения на физ.-хим. свойства, стабильность и функцию молекулы Г. зависит от типа аминокислоты, к-рая заменила прежнюю, и ее положения в молекуле. Ряд мутаций (но не все) существенно изменяют функцию и стабильность молекулы Г. (HbM, нестабильные гемоглобины, гемоглобины с измененным сродством к O 2) или ее конфигурацию и ряд физ.-хим. свойств (HbS и HbC).

Гемоглобины нестабильные

Гемоглобины нестабильные - группа аномальных гемоглобинов, отличающихся особой чувствительностью к действию окислителей, нагреванию и ряду других факторов, что объясняется генетически детерминированной заменой в их молекулах одних аминокислотных остатков на другие; носительство таких гемоглобинов часто проявляется как гемоглобинопатия (см.).

В эритроцитах людей - носителей нестабильных Г. появляются так наз. тельца Гейнца, представляющие собой скопления денатурированных молекул нестабильного Г. (врожденная гемолитическая анемия с тельцами Гейнца). В 1952 г. Кати (I. A. Cathie) высказал предположение о наследственном характере этого заболевания. Фрик (P. Frick), Гитциг (W. H. Hitzig) и Ветке (К. Betke) в 1962 г. впервые на примере Hb Zurich доказали, что гемолитическая анемия с тельцами Гейнца связана с присутствием нестабильных гемоглобинов. Каррелл (R. W. Carrell) и Г. Леманн в 1969 г. предложили новое название таких гемоглобинопатий - гемолитические анемии, обусловленные носительством нестабильного Г.

Нестабильность молекул Г. может быть вызвана заменой аминокислотных остатков, контактирующих с гемом; заменой остатка неполярной аминокислоты на полярную; нарушением вторичной структуры молекулы, вызванной заменой любого аминокислотного остатка остатком пролина; заменой аминокислотных остатков в области α1β1- и α2β2-контактов, что может привести к диссоциации молекулы гемоглобина на мономеры и димеры; делецией (утратой) некоторых аминокислотных остатков; удлинением субъединиц, напр, два нестабильных Г.- Hb Cranston и Hb Tak имеют удлиненные по сравнению с нормальным гемоглобином бета-цепи за счет гидрофобного сегмента, присоединенного к их C-концу.

Классификация нестабильных Г., предложенная Дейси (J. V. Dacie) и модифицированная Ю. Н. Токаревым и В. М. Белостоцким, основана на характере изменений в молекуле, делающих Г. нестабильным.

Описано ок. 90 нестабильных Г., причем варианты с заменой аминокислотных остатков в бета-цепях молекулы Г. встречаются примерно в 4 раза чаще, чем с заменой таких остатков в альфа-цепях.

Носительство нестабильных Г. наследуется по аутосомно-доминантному типу, и носители являются гетерозиготами. В ряде случаев возникновение носительства нестабильных Г. является результатом спонтанной мутации. Снижение стабильности Г. не только приводит к его легкой преципитации, но в отдельных случаях и к потере гема. Замещения аминокислотных остатков в местах контактов а- и (3-цепей молекулы Г. могут влиять на сродство молекулы к кислороду, на взаимодействие гемов и равновесие между тетрамера-ми, димерами и мономерами гемоглобина. У людей, гетерозиготных по генам нестабильного Г., синтезируется как нормальный, так и аномальный, нестабильный Г., однако последний быстро денатурирует и становится функционально неактивным.

Тяжелая гемолитическая анемия обычно отмечается у больных, являющихся носителями нестабильных Г. с высокой степенью нестабильности молекулы.

При носительстве других нестабильных Г. клин, проявления обычно бывают средней тяжести или совсем незначительными. В ряде случаев (Hb Riverdale-Bronx, Hb Zurich и др.) носительство нестабильного Г. проявляется в виде гемолитических кризов после приема некоторых лекарств (сульфаниламидов, анальгетиков и др.) или воздействия инфекций. У некоторых больных, напр, носителей Hb Hammersmith, Hb Bristol, Hb Sydney и др., отмечается цианоз кожи, вызванный повышенным образованием мет- и сульфгемоглобинов. Гемоглобинопатии, обусловленные носительством нестабильных Г., следует дифференцировать с гемолитическими и гипохромными анемиями другой этиологии и прежде всего с железодефицитными и гемолитическими анемиями, связанными с генетически обусловленным дефицитом ферментов пентозо-фосфатного цикла, гликолиза и др.

Большинство людей - носителей нестабильных Г. не нуждается в специальном лечении. При гемолизе полезна общеукрепляющая терапия. Всем носителям нестабильных Г. рекомендуется воздерживаться от лекарств-окислителей, провоцирующих гемолиз (сульфаниламиды, сульфоны, анальгетики и др.). Гемотрансфузии показаны только при развитии глубокой анемии. При тяжелом гемолизе с повышенной секвестрацией эритроцитов селезенкой и гиперспленизме показана спленэктомия (см.). Однако спленэктомию детям (до 6 лет) обычно не производят из-за риска развития септицемии.

Методы выявления нестабильных гемоглобинов

Исследование термолабильности гемоглобина - важнейший тест выявления его нестабильности. Он предложен Граймсом (A. G. Grimes) и Мейслером (A. Meisler) в 1962 г. и Дейси в 1964 г. и заключается в инкубации гемолизатов, разбавленных 0,1 М фосфатным или трис-HCl буфером, pH 7,4, при 50-60° в течение часа. При этом нестабильные Г. денатурируются и выпадают в осадок, а количество оставшегося в р-ре термостабильного Г. определяют спектрофотометрически при 541 нм и рассчитывают по формуле:

/ * 100 = = термостабильный гемоглобин (в процентах),

где E - величина экстинкции при длине волны 541 нм.

Относительное содержание термолабильного Г. равно 100% - количество термостабильного Г. (в процентах).

Каррелл й Кей (R. Кау) в 1972 г. предложили инкубировать гемолизаты в смеси 17% р-р изопропанола- трис-буфер, pH 7,4 при 37° в течение 30 мин.

Гемолиз эритроцитов можно вызвать водой, т. к. использование для этой цели четыреххлористого углерода или хлороформа приводит к частичной денатурации нестабильных Г. и искажению получаемых данных.

Наиболее распространенным методом определения нестабильных Г. является гистохим, метод выявления телец Гейнца. Эритроциты при этом окрашивают кристаллическим фиолетовым, метиловым фиолетовым или используют реакцию с ацетилфенилгидразином. Кровь предварительно выдерживают в течение суток при 37°. Следует иметь в виду, что тельца Гейнца могут обнаруживаться и при других гемолитических анемиях, талассемии, при отравлении метгемоглобинообразователями и при некоторых энзимопатиях.

Электрофоретическое разделение гемолизатов на бумаге или ацетат-целлюлозе часто не дает результатов, т. к. у многих нестабильных Г. замена аминокислотных остатков в молекуле не вызывает изменения электрофоретических свойств молекулы. Более информативны в этом отношении электрофорез в полиакриламидном и крахмальном гелях (см. Электрофорез) или изоэлектрическое фокусирование.

У многих больных, являющихся носителями нестабильных Г., моча постоянно или временами приобретает темный цвет вследствие образования дипирролов, что служит достаточно точным признаком присутствия в эритроцитах нестабильных Г.

Библиография: Владимиров Г. Е. и Пантелеева Н. С. Функциональная биохимия, Л., 1965; И р ж а к Л. И. Ге-моглобины и их свойства, М., 1975, библиогр.; Коржуев П. А. Гемоглобин, М., 1964, библиогр.; Кушаковский М. С. Клинические формы повреждения гемоглобина, Л., 1968; Перу тц М. Молекула гемоглобина, в кн.: Молекулы и клетки, под ред. Г. М. Франка, пер. с англ., с. 7, М., 1966; т у-м а н о в А. К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств, М., 1975, библиогр.; Успенская В. Д. О месте синтеза и катаболизма гаптоглобина и его роли в обмене гемоглобина, Вопр. мед. химии, т. 16, № 3, с. 227, 1970, библиогр.; Харрис Г. Основы биохимической генетики человека, пер. с англ., с. 15, М., 1973; Шаронов Ю. А. иШаронова Н. А. Структура и функции гемоглобина, Молекулярная биол., т. 9, № 1, с. 145, 1975, библиогр.; С h а г а с h e S. Haemoglobins with altered oxygen affinity, Clin. Haemat., v. 3, p. 357, 1974, bibliogr.; Giblett E. R. Genetic markers in human blood, Philadelphia, 1969; Hemoglobin and red cell structure and function, ed. by G. J. Brewer, N. Y.-L., 1972; HuehnsE. R. Genetic control of haemoglobin alpha-chain synthesis, Haematolo-gia, v. 8, p. 61, 1974, bibliogr.; Leh-mannH. a. Hunt s m a n R. G. Man’s haemoglobins, Philadelphia, 1974; P e-r u t z M. F. The croonian lecture, 1968, The haemoglobin molecule, Proc, roy, Soc. В., v. 173, р. 113, 1969; P e rut z М. F* a. Lehmann H. Molecular pathology of human haemoglobin, Nature (Lond.), v. 219, p. 902, 1968; RoughtonF. J. Some recent work on the interactions of oxygen, carbon dioxide and haemoglobin, Biochem. J., v. 117, p. 801, 1970;S t a m a-toyannoponlos G. a. NuteP. E. Genetic control of haemoglobins, Clin. Haemat., v. 3, p. 251, 1974, bibliogr.; Van Assendelft O. W. Spectrophotometry of haemoglobin derivatives, Assen, 1970; Weatherall D. J. Molecular basis for some disorders of haemoglobin, Brit, med. J., v. 4, p. 451, 516, 1974; Weatherall D. J. a. Clegg J. B. Molecular basis of thalassaemia, Brit. J. Haemat., v. 31, suppl., p. 133, 1975; Wintro-b e М. M. Clinical hematology, Philadelphia, 1974.

Гемоглобины нестабильные - Дидковский Н. А. и др. Гемоглобин Волга ft 27 (В9) аланин->аспарагиновая кислота (новый аномальный гемоглобин с выраженной нестабильностью), Пробл, гематол, и перелив, крови, т. 22, № 4, с. 30, 1977, библиогр.; И д e л ь-с о н Л. И., Дидковский Н. А. и Ермильченко Г. В. Гемолитические анемии, М., 1975, библиогр.; В u n n H. F., Forget B. G. a. R a n n e y H. M. Human hemoglobins, Philadelphia, 1977, bibliogr.; Lehmann H. a. K y-n o с h P. A. Human haemoglobin variants and their characteristics, Amsterdam, 1976.

А.П. Андреева; Ю. H. Токарев (гем. и ген.), А. К. Туманов (суд.).; Ю. H. Токарев, В. М. Белостоцкий.

Гемоглобин (Нв) – сложный белок (хромопротеид) - окрашивает эритроциты в красный цвет, состоит из белка глобина и четырех молекул гема. Гем является активной частью и содержит двухвалентное железо, одна молекула гема способна присоединять и отдавать одну молекулу кислорода. Глобин является белковым носителем гема. Гемоглобин в легких присоединяет к себе кислород, образуя непрочное, легко диссоциируемое соединение – оксигемоглобин (НвО2). Кровь, насыщенная оксигемоглобином (артериальная), поступает в ткани организма, где оксигемоглобин распадается на восстановленный гемоглобин и кислород. Восстановленный гемоглобин (дезоксигемоглобин) в тканях соединяется с углекислым газом, образуя также непрочное соединение карбгемоглобин (НвСО2). Кровь, насыщенная восстановленным гемоглобином и карбгемоглобином (венозная) поступает в малый круг кровообращения. В крови плода находится фетальный гемоглобин (НвF), который может значительно больше насыщаться кислородом, чем гемоглобин матери. Считается, что фетальный гемоглобин синтезируется в печени, а гемоглобин взрослых животных – в красном костном мозге. Гемоглобин легко вступает в соединение с угарным газом (окись углерода), образуя карбоксигемоглобин (НвСО), который утрачивает способность к переносу кислорода. Уже при содержании во вдыхаемом воздухе только 0,04% окиси углерода наступает тяжелое отравление, а при концентрации 0,1% – гибель животного. При слабом отравлении окись углерода постепенно отщепляется, и гемоглобин восстанавливает свою способность к присоединению и переносу кислорода. При действии на гемоглобин сильных окислителей (бертолетова соль, перекись водорода, анилин и др.) образуется достаточно прочное соединение гемоглобина с кислородом - метгемоглобин (МtНв), в котором двухвалентное железо переходит в трехвалентную форму. Это соединение прочно удерживает кислород и не может отщеплять его тканям. При образовании большого количества метгемоглобина наступает гибель животного от удушья. В животноводческой практике метгемоглобин образуется при скармливании животных кормов, содержащих большое количество нитратов от внесения в почву больших доз азотистых удобрений. Качественное определение гемоглобина и его производных можно провести при помощи спектрального анализа, а количественное – различными калориметрическими методами (табл. 7.).

Для установления насыщенности эритроцитов гемоглобином определяют цветовой показатель или индекс g.

«Нв» у исследуемого животного х нормальное количество эритроцитов

«Нв» в норме х количество эритроцитов у исследуемого животного

В норме этот показатель равен 1 ± 0,15%

Миоглобин – это сложный белок, содержащийся в скелетных и сердечной мышцах. Миоглобин может связывать 14-15% общего количества кислорода. Кислород миоглобина используется мышцами при их сокращении, когда приток крови в их капиллярах уменьшается. При расслаблении мышц миоглобин снова присоединяет к себе кислород. В значительно больших количествах миоглобин содержится в мышцах морских млекопитающих, что дает им возможность длительное время находиться под водой.

Уменьшение количества эритроцитов и гемоглобина в единице объема крови называется Анемией. Она бывает абсолютной и относительной. Абсолютная полицитемия развивается вследствие раздражения красного костного мозга, при заболеваниях легких (эмфизема), сердца (пороки сердца). Относительная полицитемия развивается в условиях обезвоживания организма (при усиленном потоотделении, поносах, рвоте) В зависимости от причины происхождения различают несколько видов анемий: постгеморрагическая, гемолитическая, алиментарная, инфекционная, злокачественная.

Качественные изменения эритроцитов:

Гипохромазия - появление эритроцитов со слабой окраской, обусловленной малым содержанием гемоглобина. Такие эритроциты появляются после кровопотерь.

Гиперхромазия - появление эритроцитов с более интенсивной окраской чем в норме. Обусловлено это явление большим чем в норме содержанием гемоглобина в эритроцитах. Наблюдается при токсической и злокачественной анемии.

Полихромазия - способность эритроцитов окрашиваться и кислыми и основными красками. Это явление связано с наличием в протоплазме эритроцитов участков разной степени зрелости.

Пойкилоцитоз - наличие эритроцитов разной формы (в виде гири, запятой, грушевидные, овальные). Возникают эти формы в самой крови из менее стойких эритроцитов.

Анизоцитоз - появление эритроцитов разных размеров (микро-и макроцитов). Пойкилоцитоз и аишоцитоз свидетельствуют о функциональной недостаточности работы костного мозга.

Включения в эритроцитах могут быть как остатки ядерной субстанции - (Тельца Жолли ) или ядерной оболочки (Кольца Кабо ).

К включениям относятся и базофильная пунктация - мелкая зернистость синего цвета. Наблюдается при отравлении солями тяжелых металлов (солями свинца).

Патология красной крови

Цель занятия . Изучить нарушения, возникающие в животном организме при изменении количества крови, количественного и качественного состава ее форменных элементов

Задание 1 . Изучить последствия изменений общей массы крови у животных. Влияние гиперволемии на кровообращение в сосудах языка лягушки.

Оснащение: Препаровальные дощечки, Булавки, кюветы, микроскопы; шприцы на 5 мл с иглой, глазные пипетки; раствор Рингера (100 мл), 10%-ный раствор этилового спирта (300 мл); лягушки.

Постановка опыта . Лягушку наркотизируют алкоголем, помещают на препаровальную дощечку брюшком вверх. Булавками фиксируют верхнюю челюсть у края круглого отверстия и все четыре лапки. Иссекают кожу и грудную кость над областью сердца для лучшего доступа к сердечной мышце. Из ротовой полости осторожно извлекают язык, расправляют его над отверстием. Препарат кладут на предметный столик стереоскопического или обычного микроскопа. Изучают микроскопическую картину кровоснабжения ткани языка. В полость желудочка вводят 5-6 мл раствора Рингера и наблюдают за характером кровотока. Обращают внимание на скорость движения крови, число функционирующих сосудов, количество форменных элементов в осевом слое тока крови. Сопоставляют с исходным кровотоком.

Оформление протокола опыта . Записывают ход эксперимента. Отмечают изменения кровотока, возникшие после существенного увеличения объема циркулирующей крови.

В опытах на животных изучить изменения количественного и качественного состава эритроцитов

Моделирование и изучение гемолитической анемии у животных.

Оснащение : клетки для кроликов; кюветы; шприцы на 5 мл с иглой; смесители для красной крови; микроскопы; камеры Горяева; электрофотоколориметр; стандартный набор для определения гемоглобина гемоглобинцианидным методом; гемометры Сали; аппараты Панченкова для определения СОЭ; вата (50 г); фильтровальная бумага (30 г); 5%-ный раствор фенилгидразина (20 мл); 70%-ный раствор этилового спирта (20 мл); 1%-ный раствор натрия хлорида (70 мл); 0,1 н. раствор хлористоводородной кислоты (5 мл); 5%-ный раствор лимоннокислого натрия (5 мл); подопытные животные: кролики или животные с анемией (поросята).

Постановка опыта . На кролика массой тела более 2 кг действуют гемолитическим ядом - фенилгидразином, вызывающим тяжелую форму анемии. За четыре дня до занятий кролику в краевую вену уха в течение трех дней подряд вводят 1%-ный раствор фенилгидразина из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. В день занятий измеряют ряд показателей красной крови у подопытного и контрольного кроликов. Можно использовать анемичных поросят.

Пробы периферической крови берут из сосудов уха, для чего выстригают шерсть, кожу протирают спиртом, после высыхания прокалывают краевую вену уха иглой, вытекающую кровь используют для анализов.

Определение числа эритроцитов. В абсолютно чистый и высушенный смеситель для красной крови набирают кровь до метки 0,5. Манипуляцию взятия проводят быстро. При этом следят, чтобы не попали пузырьки воздуха. После взятия крови кончик капилляра быстро вытирают ваткой или фильтровальной бумагой, погружают в сосуд с 1%-ным раствором натрия хлорида и набирают до метки 101. Смеситель закрывают с обоих концов большим и средним пальцами рук и осторожно встряхивают содержимое в течение 1-2 мин для получения равномерной взвеси эритроцитов. Получают разведение крови в 200 раз. Подсчет форменных элементов красной крови осуществляют в камере Горяева (рис.17), которую предварительно покрывают шлифованным стеклом, притертым до появления радужных кругов (ньютоновых колец). Из меланжера (смесителя) удаляют на ватку три первые капли содержимого, а затем одну капельку взвеси эритроцитов подводят под среднюю пластинку камеры, куда жидкость поступает в силу капиллярности. Между покровным стеклом и пластинкой не должно быть пузырьков воздуха.

Поверхность сетки раз-делена на большие и малые квадраты. Часть больших разделена на 16 малых квадратов, площадь каждого составляет 1/400 мм2, высота всех камер равна 1/10 мм. Таким образом, объем малого квадрата 1/4000 мм. Подсчет клеток проводят под малым увеличением микроскопа в пяти больших квадратах, начиная с левого квадрата по диагонали. Считают эритроциты расположенные в каждом маленьком квадрате, и те, которые касаются левой и верхней стенок. Эритроциты, касающиеся правой и нижней стенок, не учитывают.

Для определения числа эритроцитов в 1 мкл крови (X ) Используют формулу

Где А - Число эритроцитов в пяти больших квадратах; B – степень разведения крови (1: 200); В – Количество маленьких квадратов в пяти больших (80); 4000 - 1/4000 объема счетной камеры над маленьким квадратом, мкл.

Для определения числа эритроцитов в 1 л крови (X ) Используют формулу Х=А – 1010.

Получают величину Т/л, где Т - Тера, равна 10 .

Определение количества гемоглобина. Наиболее точен гемогло-бинцианидный колориметрический метод. Для анализа берут опытную, стандартную и контрольную пробы. Для подготовки опытной пробы к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 20 мкл (0,02 мл) испытуемой крови, тщательно перемешивают и оставляют стоять в течение 10 мин. Затем колориметрируют при зеленом светофильтре (длина волны 500-
560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы, в качестве которой берут трансформирующий раствор. Стандартная проба - это стандартный раствор гемоглобинцианида, ее исследуют в том же порядке, что и опытную пробу.

Количество гемоглобина (Н B , Г на 100 мл) определяют по формуле

	ЕопСК ×0,001

Где Еоп - Оптическая плотность опытной пробы; Ест - оптическая плотность стандартной пробы; С - Концентрация гемоглобинцианида в стандартном растворе (59,75 мг на 100 мл); 0,001 - коэффициент для пересчета мг в 1 г; К- Коэффициент разведения крови (251).

Для установления количества гемоглобина в 1 л крови полученную цифру нужно умножить на 10.

Для определения количества гемоглобина в крови можно использовать метод Сали. Он менее точен, чем предыдущий, но прост в исполнении и широко распространен. Гемометр Сали (рис.18) состоит из трех пробирок одного диаметра, помещенных в штатив, задняя стенка которого выполнена из стекла молочного цвета. Средняя пробирка пустая, она отградуирована и предназначена для исследуемой крови. Обе боковые Пробирки запаяны и наполнены стандартным эталонным раствором, содержащим 167 г/л гемоглобина. К гемометру приложены капиллярная пипетка емкостью 20 мм3, пипетка для воды, стеклянная палочка для размешивания.

Принцип определения заключается в том, что под действием разведенной хлористоводородной (соляной) кислоты гемоглобин превращается в солянокислый гематин. Полученный раствор гематина разбавляют в градуированной (средней) пробирке дистиллированной водой до тех пор, пока его цвет не совпадет с цветом стандартных растворов. Количество гемоглобина устанавливают по уровню жидкости в градуированной пробирке в соответствии с имеющейся шкалой.

Для выполнения исследования в градуированную пробирку приливают 0,1 н. раствор хлористоводородной кислоты до метки 0. Из свежей капли крови кролика капиллярной пипеткой набирают 20 мкл. Оттуда кровь (без потерь) приливают к хлористоводородной кислоте в градуированной пробирке, тщательно встряхивают и оставляют стоять в штативе гемометра на 5-10 мин до образования прозрачной бурой жидкости - солянокислого гематина. Дистиллированную воду капают до тех пор, пока цвет жидкости не сравняется с цветом стандартных растворов гемометра Сали. При этих условиях количество гемоглобина будет одинаковым в стандарте и в исследуемой крови. Отсчет ведут по нижнему мениску жидкости в градуированной пробирке, шкала которой показывает абсолютное содержание (г/100 мл) гемоглобина в исследуемой крови. Далее рассчитывают содержание гемоглобина в ммоль/л. Используют формулу

Где В - Количество гемоглобина (г/100 мл, г%), 0,6206 - коэффициент пересчета. Например, 5 = 9 г%, тогда 9 ∙ 0,6206 = 5,6 ммоль/л (по системе СИ).

Вычисление цветового показателя (ЦП). Для определения степени насыщенности эритроцитов гемоглобином используют формулу

Где Hb 1 - среднее количество гемоглобина в норме (г/л); Н B 2 - Количество гемоглобина у исследуемого животного (г/л); Е1 - среднее число эритроцитов в норме (1 ∙ 1012/л); E2 - среднее число эритроцитов у исследуемого животного (1 ∙ 1012/л).

Вычисление среднего содержания гемоглобина в одном эритроците. Для определения этой величины используют данные о содержании эритроцитов и количестве гемоглобина в 1 мкл (1 л) крови. Для вычисления содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ), выраженного в пг (1 пг = 1 × 1012 г), применяют формулу

Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по методу Панченкова. Вычисляют скорость разделения цельной крови на плазму светло-желтой окраски и форменные элементы красной окраски за счет гемоглобина эритроцитов. Для определения берут градуированный стеклянный капилляр (от 0 до 100 мл), промывают его 5%-ным раствором лимоннокислого натрия. Набирают раствор до метки Р (высота 50 мм) и выпускают на часовое стекло. Из капли крови, взятой от кролика, в тот же капилляр дважды набирают кровь до метки К И приливают ее к раствору лимоннокислого натрия в часовое стекло, тщательно перемешивая жидкости. Затем капилляр наполняют цитратной кровью и укрепляют в штативе в строго вертикальном положении (рис.19). Результат оседания эритроцитов отмечают через час. Выражают СОЭ в мм/ч.

Рис.19. Штатив и капилляры для определения СОЭ

Таким образом, у контрольного и интактного кроликов определяют содержание в крови числа эритроцитов, количество гемоглобина, цветовой показатель, среднее содержание гемоглобина в одном эритроците, СОЭ. Используя полученные данные, составляют общую картину изменений красной крови при гемолитической анемии.

Оформление протокола опыта. Кратко описывают принципы определения показателей красной крови, использованные в эксперименте. Выполняют расчеты по рекомендованным формулам, фиксируют в протоколе. Полученные данные вносят в таблицу. Объясняют механизм изменений картины крови при гемолитической анемии.

Определение содержания гемоглобина в крови животных является одним из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гену различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора .

Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и

быстрые в исполнении. Кровь животного - это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа .

Повышение: некоторые формы гемобластозов, в частности эритремия, обезвоживание организма.

Понижение (анемия): различные виды анемий, в том числе вследствие кровопотери.

Принцин гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну - гемиглобинцианид. Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну - гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфат натрия, происходит его превращение в окисленную низкоспиновую форму - гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г./л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.

При определении гемоглобина двумя методами Ахрем А.А. с соавторами показали, что большую точность (и меньшую s) дает гемихромный метод. Авторы предполагают, что SDS способствует солюбилизации мембранных частиц и препятствует адсорбции белка на стекле пробирок и кювет, тем самым обеспечивается высокая точность анализа .

Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99. Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.

Выполнение. В сухие чистые пробирки дозатором внести по 5 мл трансформирующего раствора, к ним прилить по 20 мкл крови поверенной пипеткой Сали или механическим дозатором со всеми предосторожностями, перечисленными в предыдущем разделе. Пробу тщательно перемешать на микровстряхивателе или вручную до достижения гомогенного раствора. Растворы выдержать при комнатной температуре время, указанное в инструкции к набору, и измерить оптическую плотность растворов на поверенном, калиброванном приборе в кювете, имеющей нулевое поглощение дистиллированной воды относительно аналогичной контрольной (с длиной оптического пути 10 мм). Окраска растворов устойчива до 5 час и более, что позволяет проводить измерения в любое удобное время в этом временном интервале. Расчет содержания гемоглобина в крови произвести по калибровочному графику или фактору, определенному на данном приборе. Если соблюдены все перечисленные условия подготовки и проведения анализа, описанные выше, погрешность определения гемоглобина в крови не будет превышать ±2%. Кратко суммируем источники возможных ошибок при определении гемоглобина: использование некалиброванных пипеток и несовершенная техника дозирования проб крови; применение неповеренного оборудования, не обеспечивающего линейную зависимость оптической плотности от концентрации гемоглобина в требуемой области измерений; нестабильность прибора; отсутствие внутрилабораторного контроля качества; недостаточная чистота кювет, особенно проточных; ошибки при построении калибровочных графиков и расчете факторов; использование контрольных растворов гемоглобина низкого качества; ошибки оператора, ошибки, допускаемые на преаналитической фазе .

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

хорошую работу на сайт">

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ КРОВИ

План

1. Определение гемоглобина и клиническая интерпретация результатов

2. Подсчет количества эритроцитов и клиническая оценка изменения их числа

3. Расчет индексов красной крови и их значение в дифференциальной диагностике анемий

4. Методы и клиническое значение определения количества лейкоцитов

1. Определение гемоглобина и клиническая интерпретация результатов

Для определения концентрации гемоглобина предложено довольно большое количество различных методик. Наибольшее распространение получили колориметрические, основанные на колориметрии производных гемоглобина.

Кроме этих иногда применяют газометрические методы (Hb насыщают кислородом или углекислым газом и по их количеству определяют концентрацию Hb). Также существует метод, основанный на определении железа в гемоглобине, который содержит 0,347% элемента.

В качестве унифицированного и даже стандартного метода в медицине принят цианметгемоглобиновый метод с применением ацетонангидрина. Принцип методики основан на том, что гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин) под действием железосинеродистого калия (красной кровяной соли). Образующийся с ацетонангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемоглобинцианид) определяют на фотоэлектроколориметре, спектрофотометре или гемоглобинометре.

При определении гемоглобина этим методом 0,02 мл (20 мкл) крови (стабилизированной или свежеполученной) вносят в 5 мл трансформирующего раствора, который состоит из ацетонциангидрина, железосинеродистого калия и гидрокарбоната натрия. Раствор хорошо перемешивают, оставляют на 10 мин, после чего колориметрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против «холостой пробы» (трансформирующий раствор). Расчет производят по колибровочному графику.

Наиболее простым и также достаточно широко распространенным в лабораторной практике является колориметрия солянокислого гематина, на котором основан метод Сали (1895 г.). Для этого необходим гемометр, представляющий собой штатив, в котором имеются три пробирки. В крайних пробирках находится стандарт и они запаяны, средняя пробирка имеет градуировку. В нее, до нижней метки наливают 0,1 н раствор соляной кислоты, затем вносят 0,02 мл стабилизированной крови. Для того, чтобы эритроциты полностью разрушились, ждут 5 мин. (при исследовании крови млекопитающих) или 10 мин. (при исследовании крови птиц). Гемоглобин, взаимодействуя с HCl, превращается в солянокислый гематин, имеющий темно-коричневый цвет. Затем в пробирку приливают по каплям дистиллированную воду до тех пор, пока проба по цвету не будет соответствовать стандарту. Результат считывают по шкале, нанесенной на пробирку.

Метод чрезвычайно прост и быстро выполним, но недостаточно точен. При суммировании различных погрешностей этого метода ошибка составляет +30%. Поэтому в настоящее время метод не может быть рекомендован для лабораторной практики.

У здоровых животных концентрация гемоглобина составляет (г/л): крупный рогатый скот - 100-130; овца - 90-133; коза - 100-150; лошадь - 80-140; свинья - 90-110; собака - 110-170.

Увеличение концентрации гемоглобина называется гиперхромемия. Наблюдается при диарее, рвоте, гипергидрозе, образовании экссудатов и транссудатов, миоглобинурии, эмфиземе легких. Гипохромемия (олигохромемия) или уменьшение количества гемоглобина чаще регистрируется при анемии. При этом следует иметь ввиду, этот симптом является типичным для т.н. дефицитных форм анемии (недосточность железа, витамина В 12 , ферментов идр.).

Определение концентрации гемоглобина имеет также прогностическое значение. Прекращение снижения или постепенное повышение концентрации гемоглобина является благоприятным симптомом, уменьшение же его количества до 50 г/л - это неблагоприятный признак. Выявление показателя в 30 г/л является угрожающим для жизни животного симптомом.

ГЕМАТОКРИТ

Гематокрит представляет собой объемную фракцию эритроцитов в цельной крови. Зависит от количества эритроцитов и их объема. В современных гематологических анализаторах показатель гематокрита устанавливается расчетным методом -- по параметрам, выводимым из количества эритроцитов и их объема.

В норме гематокрит составляет 0,40-0,50 л/л крови; у новорожденных несколько выше.

Биологическим материалом для исследования служит венозная или капиллярная кровь. Венозная кровь берется с трилоном Б (ЭДТА); капиллярная собирается в гематокритный капилляр, обработанный гепарином.

Повышение гематокрита может быть связано либо с гиперпродукцией эритроцитов, либо с увеличением их размера.

Показатель гематокрита увеличивается при: эритроцитозах;

полицитемии -- заболевании, связанном с усилением продукции клеток «красной» крови;

компенсаторной реакции, направленной на улучшение снабжения тканей кислородом, например, у больных, страдающих хроническими заболеваниями легких, легочной недостаточностью, тяжелыми пороками сердца, при нахождении на больших высотах, при почечной патологии (сужении почечных артерий, вызывающем недостаточное кровоснабжение и гипоксию ткани почек;

заболеваниях самих почек при образовании в почках полостей, заполненных жидкостью; новообразованиях почек, сопровождающихся усилением образования эритропоэтина. При всех этих состояниях усиливается выработка в почечной ткани особого вещества -- эритропоэтина, способствующего повышению продукции эритроцитов костным мозгом, возрастанию гематокрита. Его увеличение происходит и при беременности.

Увеличение гематокрита относительного характера наблюдается при обезвоживании организма, вызванном разными причинами, в том числе: перемещением жидкости в кишечник (при его непроходимости); потерей содержимого желудочно-кишечного тракта при неукротимой рвоте, профузных поносах (сопровождается сгущением крови, а следовательно, и увеличением гематокрита), чрезмерном потоотделении, ожоговой болезни, перитоните;

нахождении на больших высотах.

Уменьшение содержания эритроцитов и показателя гематокрита может наблюдаться при:

потере крови (острых кровотечениях);

снижении темпа образования эритроцитов в костном мозге;

ускоренном разрушении красных кровяных телец;

увеличении объема крови при нормальном содержании в ней эритроцитов (например, после внутривенного введения жидкости больным со сниженной выделительной функцией почек); анемии;

увеличенном объеме циркулирующей плазмы при беременности (особенно во второй половине); гиперпротеинемии; гипергидратации.

2. Подсчет количества эритроцитов и клиническая оценка изменения их числа

Эритроциты, также как лейкоциты и тромбоциты относятся к форменным элементам крови. Эритроциты - самые многочисленные форменные элементы крови, которые содержат гемоглобин. Следовательно, их основная функция в организме - осуществление газообмена. С помощью гемоглобина эритроциты переносят кислород и углекислоту. Кроме того, эритроциты доставляют клеткам аминокислоты и липиды, принимают участие в регуляции кислотно-щелочного равновесия, выполняют защитную и другие жизненно важные функции, которые более подробно рассматривали в курсе физиологии.

Содержание эритроцитов в крови здоровых животных и птицы довольно постоянное, поэтому установление изменения их количества имеет диагностическое значение. Правда, колебания их числа можно наблюдать в зависимости от времени суток исследования, возраста, пола, продуктивности, физической нагрузки животного. Так, например, количество эритроцитов днем несколько меньше чем вечером, у новорожденных их содержание выше чем у взрослых, также как и у самцов по сравнению с самками. У высокопродуктивных коров показатели содержания эритроцитов выше чем у малопродуктивных. Установлено также, что у лошадей после физической нагрузки (например 10- минутная прогонка рысью - проба по Домрачеву) число эритроцитов увеличивается на 20 и более процентов.

Все эти факторы необходимо учитывать при клинической оценке результатов определения количества эритроцитов. Для подсчета эритроцитов предложено несколько методов, из которых унифицированными в медицинской практике являются два:

1. Подсчет в счетной камере с применением микроскопа;

2. Подсчет посредством электронных автоматических счетчиков. Ранее практиковались методы определения числа эритроцитов с помощью эритроседиометра (градуированной пробирки для определения СОЭ по Неводову), эритрогемометра и фотоэлектроколориметра, однако, из-за низкой их точности, в настоящее время они не используются. Погрешность же метода подсчета форменных элементов в камере составляет + 2-5%, а в автоматических анализаторах и того меньше - до + 2%. Это и предопределяет широкое применение названных методов не только в лабораторной практике, но и в научных исследованиях.

Подсчет эритроцитов в камере. Принцип метода заключается в том, что точное количество крови равномерно смешивают с определенным количеством жидкости. Разведенную кровь помещают в камеру с известным объемом. На дно камеры нанесена сетка, благодаря которой возможен точный подсчет эритроцитов посредством микроскопии.

Предложено несколько счетных камер, из которых наибольшее распространение в странах бывшего СССР получила счетная камера с стекой Горяева. Ее нередко так и называют "камера Горяева", хотя фактически это камера Бюркера с сеткой Горяева (1910).

Счетная камера - это толстое предметное стекло с четырьмя поперечными желобками, между которыми расположены три плоскости. Средняя плоскость на 0,1 мм тоньше боковых и разделена продольным желобом на две равные половины, на каждой из которых выгравирована сетка Гряева. Если на боковые плоскости камеры наложить покровное стекло и притереть его до появления радужных колец, т.н. "колец Ньютона", то над средней плоскостью будет щелевидное пространство высотой 1/10 мм.

Сетка Горяева имеет размер 3x3 мм, т.е. ее площадь равна 9 мм 2 . На ней нанесено 225 больших квадратов, 25 из которых разделены на 16 маленьких, 100 квадратов не разграфлено и еще 100 разделены на прямоугольники. Площадь одного маленького квадратика составляет 1/400 мм, а объем камеры над ним - 1/4000 мм.

Что касается техники подсчета эритроцитов, то здесь соблюдают следующую последовательность этапов: 1) разведение крови; 2) заправка счетной камеры; 3) собственно подсчет клеток; 4) расчет абсолютного количества эритроцитов.

1 этап. Поскольку эритроцитов в крови содержится значительное количество, например у коровы массой 400 кг - более 125 млрд. клеток, то определить их количество возможно только после разведения крови. Для разведения чаще применяют 0,85-3%-й раствор натрия хлорида или 5%-й раствор натрия цитрата. Применение растворов большей или меньшей концентрации недопустимо, поскольку приведет к разрушению эритроцитов.

Кровь разводят или в меланжере-смесителе для эритроцитов, или в пробирке (по Н.М.Николаеву, 1954). Меланжер представляет собой капиллярную трубочку длиной 10 см с шаровидным расширением. Внутри расширения находится шарик, который способствует равномерному перемешиванию крови и жидкости. Поскольку предложены меланжеры как для эритроцитов, так и для лейкоцитов, то цвет этого шарика может быть различным: красный шарик - это меланжер для эритроцитов, белый - для лейкоцитов.

Для исследования используется как стабилизированная кровь, так и не- стабилизированная сразу же после взятия. Кровь набирают в меланжер до метки "0,5" или "1". Конец смесителя очищается ваткой от крови и сразу же набирается до метки "101" разбавляющая жидкость. Отверстия смесителя закрывают большим и средним пальцами и перемешивают в течение 2-3 мин., после чего удаляют на вату первые три капли, а четвертую вносят в счетную камеру. Если кровь набирали до метки "0,5", то получают разведение в 200 раз, если до "1" - в 100 раз.

При пробирочном способе разведения крови берут 4 мл раствора натрия хлорида и вносят в пробирку. Капилляром от гемометра Сали набирают 0,02 мл крови и выдувают в пробирку, затем несколько раз промывают капилляр раствором. Разведенную при этом в 200 раз кровь тщательно перемешивают.

2 этап. Камеру располагают горизонтально и заполняют так, чтобы вся поверхность, на которую нанесена сетка, была заполнена жидкостью. При этом не должно быть образования пузырьков воздуха. После заполнения камеру оставляют строго в горизонтальном положении в течение 1 минуты для оседания эритроцитов на дно.

3 этап. Подсчет эритроцитов проводят под микроскопом, лучше при среднем увеличении (объектив х40, окуляр х7) при несколько затемненном поле, чтобы лучше просматривались линии сетки. Учет клеток ведется в пяти больших квадратах, разделенных на 16 малых. Начинают подсчет с верхнего левого большого квадрата сетки. Затем переходят к следующему квадрату, расположенному по диагонали, затем аналогично к следующему и т.д. Есть и другой принцип подсчета - в 4-х квадратах по углам ив 1-м квадрате в центре сетки.

Подсчет клеток в большом квадрате начинают с верхнего левого малого квадратика. Затем переходят ко второму, третьему и четвертому квадратику того же ряда. Сосчитав клетки первого ряда, переходят на второй и считают в обратном порядке. Таким образом подсчитывают эритроциты во всех 16 малых квадратиках и переходят к следующему большому квадрату.

Чтобы избежать повторного учета эритроцитов в большом квадрате существует два правила их подсчета:

1) подсчитываются все эритроциты, лежащие внутри квадрата и на его левой и верхней линиях. Клетки, лежащие на правой и нижней линиях, подсчитываются с другими квадратами. В крайних правых квадратах как верхних, так и нижних, клетки, лежащие на правой и нижней линиях, подсчитываются с последними квадратами. Этот метод предусматривает подсчет только тех клеток, которые лежат внутри квадратов, на линиях и прилегают к ним с внутренней стороны. Эритроциты, лежащие вне квадрата не учитываются.

2) второй метод предусматривает подсчет в том же порядке, но отличается от первого тем, что учитываются клетки, прилегающие к линиям не только изнутри, но и снаружи. Подсчет эритроцитов при этом ведется без учета таковых, прилегающих к правым и нижним линиям. По мнению большинства исследователей первый метод является более точным.

4 этап. Расчет абсолютного количества эритроцитов производится по формуле:

Где X - количество эритроцитов в 1 мкл крови;

А - количество эритроцитов, подсчитанное в 5 больших квадратах;

Б - степень разведения крови (200);

В - количество маленьких квадратиков в 5 больших квадратах (80);

Таким образом, формула имеет вид: X = А10000. Например, в 5 квадратах количество эритроцитов 590, тогда в абсолютных единицах получаем 5 900 000 клеток в 1 мкл крови. Для пересчета количества клеток в 1 л (сист. ед. СИ) необходимо результат умножить на 106, т.е. 5 900 000 10= 5,9.10 12 /л.

Подсчет эритроцитов посредством электронных автоматических счетчиков. Эти методы получают все большее распространение, поскольку позволяют автоматизировать исследование, повышают его точность и исключают субъективизм. Используются различные кондуктометрические счетчики, из которых наиболее известные типы это Культер (Франция), Целлоскоп (Швеция), Пикоскел (Венгрия) и др. Принцип работы таких счетчиков основан на различии электропроводности форменных элементов крови и жидкости, в которой они находятся. При этом клетки, проходя через микроотверстие капиллярной трубки, изменяют сопротивление электрической цепи, что регистрируется электромагнитным устройством. Число эритроцитов через 15-30 с высвечивается на цифровом табло.

В крови здоровых животных и птицы содержится следующее количество эритроцитов: крупный рогатый скот - 5,0-7,5; овцы - 7,0-12,0; козы - 12-18; лошади - 6,0-9,0; свиньи - 6,0-7,5; собаки - 5,2-8,4; куры - 3,0-4,0 на 10 /л.

Уменьшение числа эритроцитов (эритроцитопения, олигоцитемия) отмечается наиболее часто при анемиях различного происхождения (постгеморрагических, гемолитических, железо- и витаминодефицитных, гипо- и апластических, которые связаны с нарушением кроветворения). Эритроцитопения развивается также при инфекционной анемии лошадей, гематурии крупного рогатого скота, при многих острых и хронических интоксикациях.

Увеличенное содержание эритроцитов в крови - эритроцитоз (полицитемия) наблюдается чаще при заболеваниях, связанных с потерей организмом жидкости, в частности при диспептическом неонатальном и диарейном синдромах. Она бывает в начальную стадию инфекционных и лихорадочных заболеваний, при болевом абдоминальном синдроме, при пороках сердца в стадию декомпенсации, при отравлении фосфором, ртутью, окисью углерода, альвеолярной эмфиземе легких.

ЦП дает представление об отношении концентрации гемоглобина к количеству эритроцитов. Метод определения основан на сравнении полученных результатов с нормативными показателями здоровых животных.

ЦП рассчитывается по формуле:

ЦП = Hb2.E1/Hb1.E2,

где гемоглобин 1 и эритроциты 1 - это средние показатели у здорового животного данного вида и возраста; гемоглобин 2 и эритроциты 2 - это найденные показатели у исследуемого животного. Например:

У всех здоровых животных ЦП равен 1+0,15, т.е. пределы колебаний составляют от 0,85 до 1,15.

Для определения средней насыщенности эритроцитов гемоглобином рассчитывают еще один индекс: СГЭ. При этом руководствуются формулой:

СГЭ = Hb (г/л):Е (10/л).

СГЭ равно: у крупного рогатого скота - 15-20; свиней - 16-19; лошадей 17-20 пг.

Определение индексов красной крови имеет значение в дифференциальной диагностике анемий. При подострой постгеморрагической анемиии, когда одновременно уменьшается содержание гемоглобина и количество эритроцитов, ЦП приближается к 1, а СГЭ такое же как и у здоровых животных. ЦП меньше единицы и снижение СГЭ, или гипохромия, бывает при алиментарной, а также при хронической посгеморрагической анемии. Для этих нозологических форм анемии симптом гипохромии является типичным. Гиперхромия, это когда ЦП больше единицы и увеличивается СГЭ, - характерный признак гемолитической анемии, поскольку значительно уменьшается количество эритроцитов.

острой или хронической кровопотери, либо усиленного разрушения крови (гемолиз), либо нарушения образования эритроцитов в костном мозге. При многих болезнях и патологических состояниях анемия, ее глубина и характер является ведущим синдромом и определяет прогноз заболевания.

Симптомы анемии: бледность слизистых оболочек и кожи; одышка; тахикардия со стучащим сердечным толчком; гипохромемия (олигохромемия), эритроцитопения (олигоцитемия), увеличение СОЭ. При глубокой анемии может развиться коллапс. Тяжелая гемолитическая анемия проявляется гемоглобинурией.

Анемическим синдромом у животных проявляются следующие патологические состояния и болезни: наружные и внутренние, острые и хронические кровотечения; отравления гемолитическими ядами и интоксикации; гемоспоридиозы; дефицит или нарушения усвоения железа, гиповитаминозы; нарушения эритропоэза; аутоиммунные и инфекционные заболевания с геморрагическим синдромом (см.), лучевая болезнь. Анемия развивается также при недостаточном кормлении животных.

Полицитемический синдром - патологическое состояние, характеризующееся увеличением количества форменных элементов в единице объема крови. Поскольку большая часть массы форменных элементов приходится на эритроциты, такое состояние нередко именуют эритремией, хотя этот термин правомочен лишь по отношению к системным абсолютным и первичным эритроцитозам, обусловленным патологией эритроидного ростка костномозгового кроветворения. Абсолютные эритроцитозы бывают обусловлены гипоксией, стенозом легочной артерии, метгемоглобинемией. Относительные (временные) эритроцитозы связаны с потерей организмом жидкости, стрессом, системной артериальной гипертензией, повышенной физической нагрузкой.

Симптомы полицитемического синдрома: темно-вишневая окраска слизистых оболочек, кровоизлияния; эритро- и лимфоцитоз; замедление СОЭ (у рогатого скота практически отсутствует); гепатомегалия у крупного рогатого скота, спленомегалия у лошадей.

гемоглобин лейкоцит эритроцит анемия

4. Методы и клиническое значение определения количества лейкоцитов

Лейкоциты, или белые кровяные тельца, в организме выполняют прежде всего защитную функцию. В зависимости от форм они участвуют в фагоцитозе, выработке интерферона, лизоцима, гистамина и других биологически активных веществ. Лимфоциты играют основную роль в специфических защитных реакциях - формировании клеточного и гуморального иммунитета.

Для подсчета лейкоцитов предложены два метода:

1. Подсчет в счетной камере (ошибка метода +7%).

2. Подсчет в автоматических счетчиках (ошибка +2%).

При подсчете лейкоцитов используют ту же камеру с сеткой Горяева, что и для эритроцитов. Разводят кровь жидкостью Тюрка в меланжере или в пробирке. Состав жидкости Тюрка: 100 мл 3%-го р-ра уксусной к-ты и 1 мл 1%-го р-ра генциан фиолетового или метиленового синего. Ее назначение состоит в том, чтобы разрушить эритроциты и окрасить лейкоциты.

При разведении в меланжере набирают кровь в смеситель для лейкоцитов до метки "0,5" или "1", а до метки "11" - жидкость Тюрка и перемешивают в течение 2-3 мин. Получают разведение соответственно в 10 или 20 раз. Для разведения пробирочным методом в пробирку отмеривают 0,4 мл жидкости Тюрка и в нее вносят 0,02 мл крови, которую набирают капилляром Сали. Содержимое пробирки тщательно перемешивают.

Заполнение счетной камеры проводят также как и при подсчете эритроцитов. Через 1-2 мин., после оседания лейкоцитов на дно камеры, проводят подсчет лейкоцитов в 100 больших неразграфленных квадратах. Расчет абсолютного количества клеток производят по формуле:

X = А.Б/В.Г,

Где X - количество лейкоцитов в 1 мкл крови;

А - количество лейкоцитов, подсчитанное в 100 больших квадратах;

Б - степень разведения крови (20);

В - количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах (1600);

Г - объем счетной камеры над маленьким (1/4000 мм3).

Таким образом, формула имеет вид:

Например, подсчитано 180 лейкоцитов, тогда в абсолютных единицах получаем 9 000 клеток в 1 мкл крови. Для пересчета количества клеток в 1 л (сист. ед. СИ) необходимо результат умножить на 10 6 , т.е. 9 000*10 6 = 9*10%.

Принцип подсчета лейкоцитов посредством автоматических счетчиков такой же как и при определении числа эритроцитов.

В крови здоровых животных и птицы содержится следующее количество лейкоцитов: крупный рогатый скот - 4,5-12,0; овцы - 6,0-14,0; козы - 8,0-17,0; лошади - 7,0-12,0; свиньи - 8,0-16,0; собаки - 8,5-10,5; куры - 20,0-40,0 на 10 9 /л.

Увеличение количества лейкоцитов в крови - лейкоцитоз - может быть физиологическим, медикаментозным и патологическим. Физиологический лейкоцитоз бывает при беременности, после физических нагрузок, после приема корма у плотоядных, при стрессе. Медикаментозный лейкоцитоз наблюдается после парентерального введения животным белковых препаратов, вакцин, сывороток, алкалоидов и т.д.

Патологический лейкоцитоз отмечается при гнойно-воспалительных процессах, сопровождающих целый ряд внутренних болезней: бронхопневмонию, пневмонию, плеврит, перикардит, ретикулоперитонит и др. Выраженный лейкоцитоз наблюдается при многих инфекционных болезнях, лейкозах, хирургической инфекции. Возникает он и при отравлении животных ртутью, мышьяком, передозировке камфары.

Снижение числа лейкоцитов - лейкцитопения - является результатом угнетения органов кроветворения, их истощения, пониженной реактивности организма. Лейкоцитопения развивается в результате инфекционных заболеваний (классическая чума свиней, инфекционный энцефаломиелит лошадей, сальмонеллез, стахиботриотоксикоз и др.), радиационных поражений, передозировки препаратов (сульфаниламидов, левомецитина, синтомицина и др.). Выявление лейкоцитопении при заболеваниях, для которых характерен лейкоцитоз, указывает на сниженную естественную резистентность организма и тяжелое течение болезни.

Размещено на Allbest.ru

Подобные документы

Клиническое обследование коровы, состояние основных органов и систем. Анализ состояния зубов животного. Снижение количества эритроцитов и гемоглобина по результатам лабораторного исследования крови. Причины увеличения надвыменных лимфатических узлов.

курсовая работа , добавлен 24.03.2013


Форменные элементы крови: эритроциты, лейкоциты, гемоглобин, гематокрит. Методика подсчёта количества эритроцитов в единице объёма крови в камере Горяева, техника взятия крови. Функции: трофическая, экскреторная, респираторная, защитная, коррелятивная.

практическая работа , добавлен 09.10.2009


Группы крови крупного рогатого скота как основа селекционного процесса. Тестирование типов крови и их использование для определения линий и пород. Использование иммуногенетического мониторинга и биотехнологии трансплантации эмбрионов в воспроизводстве.

курсовая работа , добавлен 02.08.2010


Проектирование и анализ кормового рациона для спортивной лошади. Основная роль железа в организме. Сущность эритроцитов, лимфоцитов и гемоглобина. Характеристика эффективного использования имеющихся кормовых ресурсов в личных подсобных хозяйствах.

контрольная работа , добавлен 29.03.2015


Стресс-факторы и их влияние на физиологическое состояние и состав крови животных. Показатели осеменения коров. Повышение резистентности организма и биохимические показатели крови после лечения. Результаты экономической эффективности лечебных мероприятий.

дипломная работа , добавлен 04.05.2009


Основные функции крови: трофическая (питательная), экскреторная (выделительная), респираторная (дыхательная), защитная терморегулирующая, коррелятивная. Плазма крови, белки плазмы, небелковые азотсодержащие соединения, безазотистые органические вещества.

практическая работа , добавлен 09.10.2009


Воздействие имуномодулятора на показатели периферической крови глубокостельных коров. Нахождение эффективного метода коррекции естественной резистентности организма и внутриутробно развивающегося потомства. Воздействие тимогена на организм коров.

статья , добавлен 15.12.2009


Система органов крово- и лимфообращения, или сосудистая система. Общая характеристика кровоснабжения отдельных органов. Составные компоненты крови и их основные функции. Лимфатическая система млекопитающих животных. Ход и строение лимфатических сосудов.

реферат , добавлен 19.06.2014


Профилактика незаразных болезней. Экологические основы диспансеризации. Объем и сроки диспансерного обследования сельскохозяйственных животных. Анализ условий кормления и содержания животных. Лабораторный анализ крови, мочи, молока, рубцового содержимого.

курсовая работа , добавлен 19.12.2015


Отравление животных растениями, содержащими органические кислоты и соли, понижающими свертываемость крови, фото-сенсибилизирующими, нарушающими углеводный обмен. Клинические признаки, патологоанатомические изменения, токсикодинамика и профилактика.