Методы определения билирубина и его метаболитов. Роль печени в пигментном обмене

Билирубин образуется при распаде старых эритроцитов в
ретикулоэндотелиальной системе. Освобождающийся при этом из
гемоглобина гем разлагается. Железо реутилизируется, а из
тетрапиррольного кольца путем комплекса сложных окислительно-
восстановительных реакций образуется билирубин. Другими его
источниками являются миоглобин, цитохромы. Этот процесс происходит в
клетках РЭС, в основном в печени, селезенке, костном мозге, которые
выделяют в кровь свободный или непрямой билирубин, нерастворимый в
воде. За сутки распадается около 1% эритроцитов и образуется 100-250
мг билирубина, 5-20% его образуется из незрелых, преждевременно
разрушенных эритроцитов .Это так называемый ранний (шунтовой)
билирубин .

Значительно, от 30 до 80% увеличивается доля раннего билирубина
при заболеваниях и поражениях с неэффективным эритропоэзом. Это
свинцовое отравление, железодефицитная анемия, пернициозная анемия,
талассемия, эритропоэтическая порфирия, сидеробластическая анемия.

При этих заболеваниях имеет место увеличенная экскреция уробилина
с калом, вследствие увеличенного общего оборота желчных пигментов, без
укорочения жизни эритроцитов периферической крови. Кроме того ранний
билирубин образуется из неэритроцитарного гема, источником которого
служат, печеночные протеиды (миоглобин, каталаза, триптофанпирролаза

печени). Транспортируется прямой билирубин в связанной с альбумином
форме.

Обмен билирубина, В обмене билирубина печень выполняет 3
функции: захват (клиренс) гепатоцитом из крови синусоида билирубина;
связывание билирубина с глюкуроновой кислотой (конъюгация); выделение
связанного (прямого) билирубина из печеночной клетки в желчные
капилляры (экскреция).

Рис. 7. Схема транспорта билирубина
в печеночной клетке.

А - разрушенные эритроциты; Б -
ранний билирубин; В - свободный (непрямой)
билирубин. 1 - синусоид; 2 - гладкая
эндоплазматическая сеть; 3 - ядро; 4 -
пластинчатый комплекс; 5 - желчный каналец;
6 ~ кишка; 7 - цитоплазматические протеины.

Непрямой (свободный) билирубин
(рис.7) отделяется от альбумина в
Цитоплазменной мембране, внутриклеточные
протеины (V и Z) захватывают билирубин.

Печеночная мембрана активно участвует в
захвате билирубина из плазмы. Затем непрямой билирубин в клетке
переносится в мембраны гладкой эндоплазматической сети, где билирубин
связывается с глюкуроновой кислотой. Катализатором этой реакции является
специфический для билирубина фермент уридилдифосфат (УДФ) -
глюкуронилтрансферраза. Соединение билирубина с глюкуроновой кислотой
делает его рстворимым в воде, что обеспечивает переход его в желчь,
фильтрацию в почках и быструю (прямую) реакцию с диазореактивом,
почему и называется прямым (связанным) билирубином.

Транспорт билирубина. Выделение билирубина в желчь - это
конечный этап обмена билирубина в гепатоцитах. Печень ежедневно
выделяет до 300 мг билирубина и способна вылелить пигмента в 10 раз

больше, чем его образуется, т.е. в норме имеется значительный
функциональный резерв для экскреции билирубина. При ненарушенном
связывании переход билирубина из печени в желчь зависит от скорости
секреции желчи. Он переходит в желчь на билиарном полюсе гепатоцита с
помощью цитоплазматических мембран, лизосом и пластинчатого
комплекса. Связанный билирубин в желчи образует макромолекулярный
сложнй коллоидный раствор (мицеллу) с холестерином, фосфолипидами
и солями желчных кислот.С желчью билирубин попадает в тонкий
кишечник. Кишечные бактерии восстанавливают его с образованием
бесцветного уробилиногена. Из тонкого кишечника часть уробилиногена
всасывается и попадает в воротную вену и вновь поступает в печень
(кишечно-печеночная циркуляция уробилиногена) .В печени пигмент
полностью расщепляется.

Печень поглощает его не полностью, и небольшое количество
уробилиногена попадает в системную циркуляцию и выводится с мочой.
Большая часть образующегося в кишечнике уробилиногена окисляется в
прямой кишке до коричневого пигмента уробилина, который экскретируется
с фекалиями.

В физиологических условиях в организме (весом 70 кг) обрадуется за сутки примерно 250-300 мг билирубина. 70-80% этого количества приходится на гемоглобин эритроцитов, подвергающихся разрушению в селезенке. Ежедневно разрушается примерно около 1% эритроцитов или 6-7 г гемоглобина. Из каждого грамма гемоглобина образуется примерно 35 мг билирубина. 10-20% билирубина освобождается при расщеплении некоторых гемопротеинов, содержащих гем (миоглобин, цитохромы, каталаза и др.). Небольшая часть билирубина выделяется из костного мозга при лизисе незрелых эритроидных клеток костного мозга. Основным продуктом расщепления гемопротеинов является билирубин IX, продолжительность циркуляции которого в крови составляет 90 мин. Билирубин является продуктом последовательных стадий превращения гемоглобина, и в норме его содержание в крови не превышает 2 мг% или 20 мкмоль/л.

Нарушения пигментного обмена могут возникать в результате избыточного образования билирубина или при нарушении его выведения через желчный шунт. В обоих случаях повышается содержание билирубина в плазме крови свыше 20,5 мкмоль/л, возникает иктеричность склер и слизистых. При билирубинемии более 34 мкмоль/л появляется иктеричность кожи.

Вследствие аутокаталитического окисления двухвалентное железо гема переходит в трехвалентное, а сам гем превращается в оксипорфирин и далее – в вердоглобин. Затем железо отщепляется от вердоглобина, и под действием микросомального фермента гемоксигеназы вердоглобин превращается в биливердин, а тот при участии биливердинредуктазы переходит в билирубин. Образующийся таким образом билирубин называется непрямым или свободным, или, более понятно, – неконъюгированным . Он нерастворим в воде, но хорошо растворяется в жирах и поэтому токсичен для головного мозга. Особенно это касается той формы билирубина, которая не связана с альбуминами. Попадая в печень, свободный билирубин под действие фермента глюкуронилтрансферазы образует парные соединения с глюкуроновой кислотой и превращается в конъюгированный, прямой , или связанный билирубин – билирубин моноглюкуронид или билирубин диглюкуронид. Прямой билирубин растворим в воде и менее токсичен для нейронов головного мозга.

Билирубин диглюкуронид с желчью поступает в кишечник, где под действием микрофлоры происходит отщепление глюкуроновой кислоты и образование мезобилирубина и мезобилиногена, или уробилиногена. Часть уробилиногена всасывается из кишечника и по воротной вене поступает в печень, где полностью расщепляется. Возможно поступление уробилина в общий кровоток, откуда он попадает в мочу. Часть мезобилиногена, находящегося в толстой кишке, восстанавливается до стеркобилиногена под влиянием анаэробной микрофлоры. Последний выделяется с калом в виде окисленной формы стеркобилина. Принципиальной разницы между стеркобилинами и уробилинами нет. Поэтому в клинике их называют уробилиновыми и стеркобилиновыми телами. Таким образом, в норме в крови находят общий билирубин 8-20 мкмоль/л, или 0,5-1,2 мг%, из которого 75% относится к неконъюгированному билирубину, 5% – билирубин-моноглюкуронид, 25% – билирубин-диглюкуронид. В моче обнаруживается до 25 мг/л в сутки уробилиногеновых тел.

Возможности печеночной ткани образовывать парные соединения билирубина с глюкуроновой кислотой очень высоки. Поэтому если образование прямого билирубина не нарушено, а имеется расстройство внешнесекреторной функции гепатоцитов, уровень билирубинемии может достигать значений от 50 до 70 мкмоль/л. При повреждении паренхимы печени содержание билирубина в плазме повышается до 500 мкмоль/л и более. В зависимости от причины (надпеченочная, печеночная, подпеченочная желтухи) в крови может повышаться прямой и непрямой билирубин (Таблица 3).

Билирубин плохо растворим в воде и плазме крови. Он образует специфическое соединение с альбумином по высокоаффинному центру (свободный, или непрямой билирубин) и транспортируется в печень. Билирубин в избыточном количестве непрочно связывается с альбумином, поэтому легко отщепляется от белка и диффундирует в ткани. Некоторые антибиотики и другие лекарственные вещества, конкурирующие с билирубином за высокоаффинный центр альбумина, способны вытеснять билирубин из комплекса с альбумином.

Желтуха (icterus) – синдром, характеризующийся желтушным окрашиванием кожи, слизистых, склер, мочи, жидкости полостей тела в результате отложения и содержания в них желчных пигментов – билирубина при нарушениях желчеобразования и желчевыделения.

По механизму развития выделяют три вида желтух:

• Надпеченочная , или гемолитическая желтуха, связанная с повышенным желчеобразованием вследствие усиленного распада эритроцитов и гемоглобин содержащих эритрокариоцитов (например, при В 12 , фолиево-дефицитных анемиях);

· Печеночная , или паренхиматозная желтуха, вызванная нарушением образования и выделения желчи гепатоцитами при их повреждении, холестазе и энзимопатиях;

· Подпеченочная , или механическая желтуха, возникающая в результате механического препятствия выделению желчи по желчевыводящим путям.

Надпеченочная, или гемолитическая, желтуха. Этиология : причины следует связать с усиленным гемолизом эритроцитов и разрушением гемоглобинсодержащих эритрокариоцитов в результате неэффективного эритропоэза (острый гемолиз, вызванный разными факторами, врожденные и приобретенные гемолитические анемии, дизэритропоэтические анемии и т.п.).

Патогенез . Усиленный против нормы распад эритроцитов ведет к увеличенному образованию свободного, непрямого, неконъюгированного билирубина, который является токсичным для ЦНС и других тканей, в т.ч. для гемопоэтических клеток костного мозга (развитие лейкоцитоза, сдвиг лейкоцитарной формулы влево). Хотя печень обладает значительными возможностями для связывания и образования неконъюгированного билирубина, при гемолитических состояниях возможна функциональная ее недостаточность или даже повреждение. Это ведет к понижению способности гепатоцитов связывать неконъюгированный билирубин и далее превращать его в конъюгированный. Содержание билирубина в желчи увеличивается, что является фактором риска для образования пигментных камней.

Таким образом, не весь свободный билирубин подвергается переработке в конъюгированный, поэтому определенная его часть в избыточном количестве циркулирует в крови.

• Это получило наименование (1) гипербилирубинемия (более 2 мг%) за счет неконъюгированного билирубина.
• (2) ряд тканей организма испытывает токсическое действие прямого билирубина (сама печень, центральная нервная система).
• (3) вследствие гипербилирубинемии в печени и других экскреторных органах образуется избыточное количество желчных пигментов:
• (а) глюкурониды билирубина,
• (б) уробилиноген,
• (в) стеркобилиноген, (что ведет к усиленному их выведению),
• (4) выведение избыточного количества уробилиновых и стеркобилиновых тел с калом и мочой.
• (5) вместе с тем, имеет место гиперхолия – темная окраска кала.

Итак, при гемолитической желтухе наблюдаются:

Гипербилирубинемия за счет неконъюгированного билирубина; повышенное образование уробилина ; повышенное образование стеркобилина ; гиперхолический кал; отсутствие холемии , т.е. в крови не обнаруживается повышенного содержания желчных кислот.

Печеночная, или паренхиматозная, желтуха. Этиология. Причины печеночной желтухи разнообразны

• Инфекции (вирусы гепатита A, B, C , сепсис и т.п.);

· Интоксикации (отравление грибным ядом, алкоголем, мышьяком, лекарственными препаратами и т.п.). Считается, например, что около 2% всех случаев желтух у госпитализированных больных имеют лекарственное происхождение;

• Холестаз (холестатический гепатит);
• Генетический дефект ферментов, обеспечивающих транспорт неконъюгированного билирубина, ферментов, обеспечивающих конъюгирование билирубина – глюкуронилтрансферазы.
• При генетически обусловленных заболеваниях (например, синдром Криглера-Найяра, синдром Дабина-Джонсона и др.) Имеется ферментативный дефект в реакции конъюгации и при секреции. У новорожденных может быть транзиторная ферментативная недостаточность, проявляющаяся в гипербилирубинемии.

Патогенез. При повреждении гепатоцитов, как это бывает при гепатитах или приеме гепатотропных веществ, в разной степени нарушаются процессы биотрансформации и секреции, что отражается в соотношении прямого и непрямого билирубина. Однако обычно преобладает прямой билирубин. При воспалительных и иных повреждениях гепатоцитов возникают сообщения между желчными путями, кровеносными и лимфатическими сосудами, через которое желчь поступает в кровь (и лимфу) и частично в желчевыводящие пути. Этому же может способствовать отек перипортальных пространств. Набухшие гепатоциты сдавливают желчные протоки, чем создаются механические затруднения оттоку желчи. Метаболизм и функции печеночных клеток нарушаются, что сопровождается следующими симптомами:

· Гипербилирубинемия за счет конъюгированного и, в меньшей степени, непрямого билирубина. Повышение содержания неконъюгированного билирубина обусловлено снижением активности глюкуронилтрасферазы в поврежденных гепатоцитах и нарушением образования глюкуронидов.

• Холалемия – наличие в крови желчных кислот.
• Увеличение в крови конъюгированного растворимого в воде билирубина ведет к появлению в моче билирубина – билирубинурия , а дефицит желчи в просвете кишечника – постепенному снижению содержания уробилина в моче вплоть до полного его отсутствия. Прямой билирубин является водорастворимым соединением. Поэтому он фильтруется через почечный фильтр и выводится с мочой
• Снижение количества стеркобилина вследствие ограниченного его образования в кишках, куда поступает уменьшенное количество глюкуронидов билирубина в составе желчи.
• Снижение количества желчных кислот в кишечном химусе и кале вследствие гипохолии. Уменьшенное поступление желчи в кишечник (гипохолия) вызывает расстройства пищеварения.
• Более весомое значение имеют нарушения межуточного обмена белков, жиров и углеводов, а также дефицит витаминов. Снижается защитная функция печени, страдает свертывающая функция крови.

Таблица 3

Патогенетические механизмы гипербилирубинемии

При физиологических условиях концентрация билирубина в плазме составляет 0,3-1,0 мг/дл (5,1-17,1 мкмоль/л). Если уровень билирубина в плазме составляет около 3 мг/дл (50 мкмоль/л), то клинически это проявляется в форме желтушного окрашивания склер, слизистых оболочек и кожи.

Билирубин происходит из ферментативного разрушения гемоглобина или гемопротеинов (цитохром Р 450 , цитохром В 5 , каталаза, триптофанпирролаза, миоглобин). Таким образом, образованный билирубин представляет собой субстрат для билирубин-УДФ-глюкуронилтрансферазы, содержащейся в эндоплазматическом ретикулуме. УДФ-глюкуронилтранс-фераза катализирует образование билирубинмоноглюкуронидов. Затем происходит синтез билирубиндиглюкуронидов, осуществляемый УДФ-глюкуронилтрансферазой. Посредством глюкуронирования нерастворимый в воде билирубин приобретает водорастворимость.

Главным источником образования билирубина является гем гемоглобина. Около 70% ежедневно образующихся желчных пигментов возникают из гемоглобина при распаде эритроцитов в ретикуло-эндотелиальной системе (в селезенке, костном мозге и в печени).

В плазме транспортируется как конъюгированный с глюкуроновой кислотой билирубин, так и неконъюгированный, связанный с альбумином билирубин. При этом конъюгированный с глюкуроновой кислотой билирубин характеризуется незначительным сродством с альбумином. Таким образом, незначительная часть билирубинглюкуронида при желтухе не связана с альбумином, она фильтруется через клубочки. Небольшая часть не реабсорбируется в канальцах, а выделяется с мочой и обусловливает наблюдаемую при холестазе билирубинурию.

В печени находящийся в плазме крови связанный с альбумином неконъюгированный билирубин, а также конъюгированный с глюкуроновой кислотой билирубин очень быстро воспринимается синусоидной стороной гепатоцитов. Захват гепатоцитами билирубина осуществляется с помощью рецепторных белков и подчиняется кинетике насыщения по Михаэлису-Ментену. Конгъюгированный билирубин, бромсульфалеин и синдоциановый зеленый также воспринимаются теми же рецепторными белками на синусоидной стороне гепатоцитов, в то время как желчные кислоты не конкурируют с билирубином за поглощение их гепатоцитами.

После конъюгации глюкуронированный билирубин, вероятно, с помощью переносчика, поступает в желчь. Поскольку неконъюгированный билирубин растворим в желчи, то этим объясняется частота образования билирубиновых пигментных желчных камней при хроническом гемолизе.

В желчных путях и в кишке сецернируемый билирубинглюкуронид не всасывается, но проходит через тонкий кишечник и гидролизуется в терминальном отделе тонкой кишки и толстой кишки при помощи бактериальной -глюкуронидазы. Билирубин восстанавливается бактериями толстого кишечника до уробилиногена и частично окисляется до уробилина в фекалиях. Не менее чем 20% ежедневно образуемого в толстом кишечнике уробилиногена участвуют в кишечно-печеночном цикле: он всасывается в тонком кишечнике, транспортируется в желчь, в то время как оставшиеся 10% находятся в периферической циркуляции и затем выводятся с мочой. При гемолизе, гепатоцеллюлярных заболеваниях печени и при портосистемном шунте выведение уробилина в моче увеличивается.