Метод получения интерферонов имеющий наибольшие преимущества. Интерфероны, их характеристика

Самыми первыми, кто всерьёз заинтересовался генной инженерией , были фармацевтические фирмы. Они быстро поняли, что, благодаря новым технологиям, можно получать практически любые белки и в больших количествах.

Что такое белок? Это рабочая молекула клетки. Она играет огромную роль в регуляции тех процессов, которые идут в организме. Почти все гормоны представляют собой небольшие белковые молекулы. Они содержат несколько десятков аминокислотных остатков.

До генной инженерии производство гормонов было чрезвычайно сложным делом. Людям просто повезло с инсулином, так как он являлся животным белком, взятым у свиньи или крупного рогатого скота, и мог служить заменой гормона человека. Но в большинстве случаев такое просто невозможно. А вот, благодаря генной инженерии, за короткий срок были получены штаммы бактерий, способные вырабатывать самые разнообразные человеческие гормоны.

Для примера можно рассмотреть гормон роста. Организм может его не вырабатывать в результате генетического дефекта. В этом случае человек становится карликом. Чтобы такое предотвратить, ребёнку необходимо вводить этот важнейший гормон. В прежние времена получить его можно было лишь из человеческих трупов. В наше же время он широко производится в лабораторных условиях.

Что же касается уже упомянутого инсулина, то он нужен в первую очередь людям, страдающим сахарным диабетом. Этот недуг распространён достаточно широко. Те, кто им страдает, в основной массе обходится животным инсулином. Но у отдельных больных он вызывает аллергию. Им нужен не животный, а человеческий инсулин. На сегодняшний день этот вопрос решён.

Интерферон

Большим достижением стала возможность получения человеческого интерферона. Интерферон - белок, который обладает чрезвычайно эффективным антивирусным действием. Самое же главное - его универсальность. Этот белок эффективен против самых разнообразных вирусов. По своей сути он является точно таким же средством для вирусов, как антибиотики для бактерий. Но есть одно важное отличие.

Антибиотик подавляет бактерию лишь в том случае, если у неё нет гена устойчивости. А для интерферона характерна видовая специфика. В человеческом организме подавлять вирусную инфекцию способен лишь человеческий интерферон, в некоторых случаях можно использовать обезьяний.

Но до недавнего времени наладить получение человеческого интерферона не удавалось. Специалисты не могли даже определить аминокислотную последовательность этого белка. Однако генно-инженерная фармакология, практически, в течение года кардинально всё изменила.

Получение интерферона

Из клеток крови, заражённых вирусной инфекцией, выделили интерфероновую мРНК. С помощью ревертазы (фермент, ведущий синтез ДНК по матрице РНК) синтезировали ген интерферона и внедрили его в плазмиду . Так был получен бактериальный штамм, способный вырабатывать искусственный интерферон. По нему определили аминокислотную последовательность. А уже по ней построили нуклеотидную последовательность гена, который был синтезирован. Его также встроили в плазмиду, и получился ещё один штамм, вырабатывающий нужный белок.

Что касается искусственного интерферона, то он оказался чрезвычайно эффективным противовирусным средством. Был осуществлён следующий опыт. Взяли 8 обезьян и разделили их на 2 группы. Всем животным ввели вирус энцефаломиокардита. К этому вирусу у животных иммунитета не было. Поэтому они были обречены на смерть.

Одна контрольная группа животных погибла по прошествию нескольких дней после заражения. А второй группе за несколько часов до заражения и затем несколько раз после заражения вводили искусственный интерферон. Все 4 обезьяны остались живы. В настоящее время данным препаратом лечат вирусные заболевания, гепатит и венерические болезни, вызываемые папилломой.

Вакцинация

Вакцинация - чрезвычайно эффективное средство по предупреждению вирусных эпидемий. Как правило, для вакцинации используются убитые вирусы. У них выведены из строя РНК, а вот белки сохранены. Убитые вирусы попадают в организм, а тот вырабатывает антитела. Если в дальнейшем в организм смогут попасть живые вирусы, то иммунная система их узнает и убьёт выработанными антителами.

Благодаря вакцинации, были ликвидированы такие страшные инфекции как оспа и чума. В Средние века от них умирали миллионы людей. Однако существуют вирусы, от которых не удаётся избавиться. Сюда можно отнести ВИЧ, вирус гриппа, а для животных вирус ящура. В данных случаях вакцинация либо вообще ничего не даёт, либо приводит к частичному успеху.

Причина заключается в изменчивости вирусов. Это означает, что в их белках происходят замены аминокислот, и эти вирусы становятся неузнаваемыми для иммунной системы человека. Соответственно, каждый год приходится проводить новую вакцинацию. Однако это чревато негативными факторами.

Когда вакцинацию проводят в огромных масштабах, то трудно гарантировать, что все вводимые в организм вирусные частицы убиты. Поэтому есть вероятность, что такое мероприятие может обернуться не спасением, а эпидемией.

А вот посредством генно-инженерной фармакологии можно получить идеальную безвредную вакцину. Для этого бактерию заставляют вырабатывать белок оболочки вируса. В этом случае вакцина вообще не содержит в себе инфицированных РНК, поэтому она уже изначально не может возбудить болезнь. А вот пробудить иммунитет может.

Такая вакцина была получена и опробована. Специалисты провели опыты с белком оболочки вируса ящура. Испытания дали определённые позитивные результаты, но не такие эффективные, как ожидалось вначале. Иммунизация такой вакцины в 1000 раз хуже, чем если использовать убитый вирус.

Вакцина против оспы

Рассматривая вопрос производства вакцин, нельзя не сказать об использовании живой вакцины против оспы. Эта история по праву заслуживает всяческого уважения. Началась она в то время, когда оспа свирепствовала на территории Европы и уносила миллионы жизней.

В то время все врачи искали средство, способное победить страшное заболевание. В 1798 году это удалось английскому врачу Эдварду Дженнеру. Он обратил внимание на тот факт, что доярки иногда заражались от коров лёгкой формой оспы. Данное заболевание было не смертельным, и женщины выздоравливали. Но зато в дальнейшем они уже не болели той оспой, от которой гибли люди.

Эдвард Дженнер начал специально заражать людей коровьей оспой. И таким образом защитил их от настоящей смертельной оспы. Так английский врач положил начало вакцинации (латинское слово vaccinus - коровья).

Коровий и человеческий вирус оспы разные, но у них много общего. Но самое главное то, что отдельные белки на поверхности коровьего вируса, который получил название вируса осповакцины, абсолютно схожи с аналогичными белками на поверхности человеческого вируса. Вот поэтому иммунная система, приведённая в боевую готовность в результате прививки вируса осповакцины, прекрасно защищает организм и от смертельного вируса оспы.

Следует заметить, что осповакцина оказалась уникальным средством для эпидемиологии. Данный вирус для человека абсолютно безвреден и чрезвычайно эффективен. В 1977 году ВОЗ объявила, что с оспой на планете покончено. А ведь она уносила десятки миллионов человеческих жизней.

Но надобность в вакцине против оспы не пропала. Сотрудники Института здравоохранения США решили посредством генно-инженерной фармакологии изменить эффективный вирус так, чтобы он защищал не только от оспы, но ещё и от гепатита.

В молекулу ДНК вируса осповакцины был встроен ген поверхностного белка вируса гепатита. При этом он был снабжён эффективным промотором (часть ДНК, с которой связывается РНК-полимераза для начала синтеза мРНК). После этого провели опыты на кроликах. Они показали, что при вакцинации таким вирусом в крови вырабатывается белок гепатита, но тут же в ответ появляются антитела, способные противостоять этому заболеванию.

Данный метод помог создать целую группу вакцин против различных вирусных заболеваний, наблюдаемых как у человека, так и у животных. За основу была взята осповакцина. В её ДНК встраивали соответствующие гены поверхностных белков. В настоящее время генно-инженерная фармакология взяла данную методику на вооружение. Она развивается чрезвычайно успешно. Ей пророчат большое будущее в борьбе со многими вирусными болезнями .

Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке сначала в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется и, в результате, образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Процедура требует соблюдения следующих условий :

Ген интерферона должен содержать три участка расщепления рестриктазой Sau 3A1, из которых один находится рядом с сигнальной частью.

Неполное расщепление гена этим ферментом позволяет выделить фрагмент гена, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый интерферон.

Триплет ATG, кодирующий цистеин, отщепляется ферментом вместе с сигнальной частью.

Для восстановления полинуклеотидной последовательности полного гена химически был синтезирован фрагмент ДНК, содержащий этот триплет, а также примыкающий к нему триплет ATG-точка инициации синтеза белка.

Этот фрагмент присоединили к изолированной части зрелого гена, в результате был восстановлен полный ген зрелого интерферона.

Реконструированный ген ввели в плазмиду таким образом, что с ним оказался рядом участок ДНК-промотор, обеспечивающий начало синтеза мРНК.

Экстракты из E. Coli, содержащие такую плазмиду, обладали противовирусной активностью.

Синтезированный генно-инженерным способом интерферон был выделен, очищен, и его физико-химические свойства оказались близкими свойствам интерферона, полученного из крови доноров. Удалось получить бактерии , способные синтезировать до 5 мг интерферона на 1 л бактериальной суспензии, содержащей примерно 10 11 бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит то количество интерферона, которое можно извлечь из 1 литра крови доноров.

В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжи и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликолизирование.

В 1991 году в США впервые для синтеза лейкоцитарного интерферона человека были употреблены генетически сконструированные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Полученнаяэффективная экспрессия гена LeIF и замена бактерий клетками дрожжей позволили увеличить производство интерферона в 10 раз.

В России в 1994 году был осуществлён полный синтез гена α- И размером примерно 600 н. п. (нуклеотидных пунктов) в Институте биоорганической химии под руководством Н. М. Колосова.

Несмотря на успехи, достигнутые в области получения интерферонов с помощью генно-инженерных технологий и их применения для лечения различных вирусных заболеваний, в том числе онкологических, предстоит решить ещё многие вопросы, касающиеся расшифровки механизмов их биосинтеза и взаимодействия с другими веществами.

Схема биологического действия интерферона представлена на рисунке 8.34.

Рис. 8.34. Механизм действия интерферона

Механизм действия интерферона можно свести к следующим основным этапам:

1. Связываясь с клеточными рецепторами, интерфероны инициируют синтез ферментов 5"-олигоаденилансинтетазы и протеинкиназы за счёт инициации транскрипции соответствующих генов;

2. Оба фермента проявляют свою активность в присутствии двухцепочных ДНК, являющихся продуктами репликации многих вирусов;

3. Фермент 5"-олигоаденилансинтетаза катализирует синтез 2" 5"-олигоаденилатов (из АТР), которые активируют клеточную рибонуклеазу;

4. Протеинкиназа фосфорилирует и тем самым активирует фактор инициации трансляции IF 2. В результате этих событий ингибируется биосинтез белка и размножение вируса (деградация иРНК и рРНК) в инфицированной клетке, что вызывает её лизис.

№ 7 Интерфероны, природа. Способы получения и применения.
Интерферон относится к важным защитным белкам иммунной системы. Открыт при изучении интерференции вирусов, т. е. явления, когда животные или культуры клеток, инфициро­ванные одним вирусом, становились нечувс­твительными к заражению другим вирусом. Оказалось, что интерференция обусловлена образующимся при этом белком, обладаю­щим защитным противовирусным свойством. Этот белок назвали интерфероном.
Интерферон представляет собой семейство белков-гликопротеидов, которые синтезируются клетками иммунной системы и соединитель­ной ткани. В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделя­ют три типа: α, β и γ-интерфероны.
Альфа-интерферон вырабатывается лейкоцитами, и он получил название лейкоцитар­ного; бета-интерферон называют фибробластным, поскольку он синтезируется фибробластами - клетками соединительной ткани, а гамма-интерферон - иммунным, так как он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками.
Интерферон синтезируется в организме постоянно, и его концентрация в крови де­ржится на уровне примерно 2 МЕ/мл (1 меж­дународная единица - ME - это количество интерферона, защищающее культуру клеток от 1 ЦПД 50 вируса). Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании виру­сами, а также при воздействии индукторов интерферона, например РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили название интерфероногенов.
Помимо противовирусного действия интер­ферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размноже­ние) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.
Механизм действия интерферона сложен. Интерферон непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со спе­циальными рецепторами клеток и оказыва­ет влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.
Применение интерферона . Действие интерферона тем эффективнее, чем раньше он начинает синтезироваться или пос­тупать в организм извне. Поэтому его использу­ют с профилактической целью при многих ви­русных инфекциях, например гриппе, а также с лечебной целью при хронических вирусных инфекциях, таких как парентеральные гепати­ты (В, С, D ), герпес, рассеянный склероз и др. Интерферон дает положительные результаты при лечении злокачественных опухолей и забо­леваний, связанных с иммунодефицитами.
Интерфероны обладают видоспецифичностью, т. е. интерферон человека менее эффек­тивен для животных и наоборот. Однако эта видоспецифичность относительна.
Получение интерферона . Получают интерферон двумя способами: а) путем инфи­цирования лейкоцитов или лимфоцитов кро­ви человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конс­труируют из него препараты интерферона; б) генно-инженерным способом - путем выра­щивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Обычно используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. Интерферон, получен­ный генно-инженерным способом, носит на­звание рекомбинантного. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил офици­альное название «Реаферон». Производство этого препарата во многом эффективнее и дешевле, чем лейкоцитарного.
Рекомбинантный интерферон нашел ши­рокое применение в медицине как профилак­тическое и лечебное средство при вирусных инфекциях, новообразованиях и при иммунодефицитах.

Интерфероны - гликопротеины, вырабатываемые клетками в ответ на вирусную инфекцию и другие стимулы. Бло­кируют репродукцию вируса в других клетках и участвуют во взаимодействии клеток иммунной системы. Различают две се­рологические группы интерферонов: I тип - ИФН-α и ИФН -β; II тип - ИФН-.γ Интерфероны I типа оказывают противовирус­ные и противоопухолевые эффекты, в то время как интерферон II типа регулирует специфический иммунный ответ и неспеци­фическую резистентность.

α- интерферон (лейкоцитарный) продуцируется лейкоцитами, обработанными вирусами и другими агентами. β-интерферон (фибробластный) продуцируется фибробластами, обработанными вирусами.

ИФН I типа, связываясь со здоровыми клетками, защищает их от вирусов. Антивирусное действие ИФН I типа может обуславливаться и тем, что он способен угне­тать клеточную пролиферацию, препятствуя синтезу аминокис­лот.

ИФН-γ продуцируется Т-лимфоцитами и NK. Стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, моноци­тов/макрофагов и нейтрофилов. Индуцирует апоптоз активированных макрофагов, кератиноцитов, гепатоцитов, клеток костного мозга, эндотелиоцитов и подавляет апоптоз периферических моноцитов и герпес-инфицированных нейронов.

Генно-инженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения лейкоцитарного интерферона включает следующие этапы: 1) об­работка лейкоцитарной массы индукторами интерферона; 2) выделение из обработанных клеток смеси иРНК; 3) получение суммарных комплемен­тарных ДНК с помощью обратной транскриптазы; 4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование; 5) отбор клонов, содержащих гены интерферона; 6) включение в плазмиду сильного промо­тора для успешной транскрипции гена; 7) экспрессия гена интерферона, т.е. синтез соответствующего белка; 8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии.

Интерфероны применяются для профи­лактики и лечения ряда вирусных инфекций. Их эффект определяется до­зой препарата, однако высокие дозы интерферона оказывают токсическое действие. Интерфероны широко применяются при гриппе и других острых респираторных заболеваниях. Препарат эффективен на ранних стадиях за­болевания, применяется местно. Интерфероны оказывают терапевтическое действие при гепатите В, герпесе, а также при злокачественных ново­образованиях.

Интерферон относится к важным защитным белкам иммунной системы. Открыт при изучении интерференции вирусов, т. е. явления, когда животные или культуры клеток, инфициро­ванные одним вирусом, становились нечувс­твительными к заражению другим вирусом. Оказалось, что интерференция обусловлена образующимся при этом белком, обладаю­щим защитным противовирусным свойством. Этот белок назвали интерфероном.

Интерферон представляет собой семейство белков-гликопротеидов, которые синтезируются клетками иммунной системы и соединитель­ной ткани. В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделя­ют три типа: α, β и γ-интерфероны.

Альфа-интерферон вырабатывается лейко­цитами и он получил название лейкоцитар­ного; бета-интерферон называют фибробластным, поскольку он синтезируется фибробластами - клетками соединительной ткани, а гамма-интерферон - иммунным, так как он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками.

Интерферон синтезируется в организме постоянно, и его концентрация в крови де­ржится на уровне примерно 2 МЕ/мл (1 меж­дународная единица - ME - это количество интерферона, защищающее культуру клеток от 1 ЦПД 50 вируса). Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании виру­сами, а также при воздействии индукторов интерферона, например РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили название интерфероногенов.

Помимо противовирусного действия интер­ферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размноже­ние) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.

Механизм действия интерферона сложен. Интерферон непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со спе­циальными рецепторами клеток и оказыва­ет влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.

Применение интерферона . Действие интерферона тем эффективнее, чем раньше он начинает синтезироваться или пос­тупать в организм извне. Поэтому его использу­ют с профилактической целью при многих ви­русных инфекциях, например гриппе, а также с лечебной целью при хронических вирусных инфекциях, таких как парентеральные гепати­ты (В, С, D), герпес, рассеянный склероз и др. Интерферон дает положительные результаты при лечении злокачественных опухолей и забо­леваний, связанных с иммунодефицитами.

Интерфероны обладают видоспецифичностью, т. е. интерферон человека менее эффек­тивен для животных и наоборот. Однако эта видоспецифичность относительна.

Получение интерферона . Получают интерферон двумя способами: а) путем инфи­цирования лейкоцитов или лимфоцитов кро­ви человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конс­труируют из него препараты интерферона; б) генно-инженерным способом - путем выра­щивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Обычно используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. Интерферон, получен­ный генно-инженерным способом, носит на­звание рекомбинантного. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил офици­альное название «Реаферон». Производство этого препарата во многом эффективнее и дешевле, чем лейкоцитарного.

Рекомбинантный интерферон нашел ши­рокое применение в медицине как профилак­тическое и лечебное средство при вирусных инфекциях, новообразованиях и при иммунодефицитах.